آموزش تصویری طراحی پرایمر با نرم افزار الیگو (Oligo)

اولین قدم در طراحی یک پرایمر یافتن توالی ژن مورد نظر است.می توان با استفاده از پایگاه داده NCBI و در Nucleotide با جست و جوی نام ژن در این پایگاه توالی ژن را به دست آورد. (برای آموزش جستجو در دیتابیس ها به مقالات بیوانفورماتیک در همین وبلاگ مراجعه کنید).  

پس از یافتن توالی ژن، فرمت FASTA آن را در برنامه الیگو کپی می کنیم. بدین طریق که نرم افزار را اجرا کرده و یک فایل جدید از new sequence باز کرده و توالی را در آن کپی می کنیم. ( در اینجا از ورژن 7 برنامه استفاده شده است.)

پس از کپی کردن توالی باید آن را به نرم افزار بشناسانیم.
برای این کار تمام توالی را انتخاب کرده و بر روی گزینه accept در بالای کادر (در تصویر با فلش نمایش داده شده) کلیک می کنیم.

با انجام این کار صفحه جدیدی در برنامه ظاهر می شود که شامل یک سری مشخصات ( طول توالی و دمای Tm و ... ) و نمودارهای Tm و G Δ است.
علاوه بر آن در این ورژن از برنامه کادری در صفحه مشاهده می شود که امکان انتخاب upper و lower را فراهم می کند.

با رفتن روی هر نوکلئوتید می توان Tm و پوزیشن آن نوکلئوتید را در کادر بالا و سمت راست توالی نوکلئوتیدها مشاهده کرد. البته برای مشاهده دقیقتر Tm می توان از منوی آنالیز در بالای صفحه melting temperature را انتخاب کرد. (در ورژن های قدیمی تر ، نمودارهای Tm و GΔ و در دو صفحه جداگانه نمایش داده می شوند و نیازی به استفاده از آنالیز نیست.)


برای انتخاب توالی های upper و lower نوکلئوتید را از 50نوکلئوتید قبل از شروع و مانده تا خاتمه انتخاب می کنیم تا تمام ژن را داشته باشیم و بخشی از آن را در PCR از دست ندهیم. نوکلئوتید مورد نظر را انتخاب می کنیم؛ با انتخاب یک نوکلئوتید به طور پیش فرض ، برنامه، 21 نوکلئوتید بعدی را رنگی می کند. با کلیک بر دایره جلوی upper یا lower در کادر Selected oligo ، دایره سبز رنگ شده و توالی انتخاب شده اگر upper باشد در بالای همان توالی و اگر lower باشد در پایین همان توالی با یک رنگ دیگر نمایش داده می شود.مشخصات آن نیز در کادر Selected oligo نمایش داده می شود. برای دیدن مشخصات دقیقتر و صحت یا نقص پرایمر باید از طریق منوی Edit ، upper و lower را انتخاب کنیم.

با انتخاب هر مورد در Edit صفحه جدیدی باز می شود که مشخصات دقیق آن را داراست ؛ مواردی مثل تعداد توالی ، Tm ، GΔ ، داشتن یا نداشتن لوپ و همچنین توالی آمینو اسیدی آن بخش از رشته. ( با کلیک بر هر آمینو اسید کدون های رمز کنند آن مشخص می شود و می توان کدون دیگری را که برای آن آمینو اسید است جایگزین فعلی کرد.)

در کادر پایین آن شکل لوپ در صورت وجود نمایش داده می شود.

• پرایمرهایی که GΔ منفی دارند و لوپ نیز تشکیل می دهند نامناسب اند ولی در صورتی که لوپ تشکیل دهند اما GΔ مثبت داشته باشند اشکال چندانی را ایجاد نمی کنند.
• بهتر است دمای Tm بین 50 تا 60 باشد تا در طی PCR آسیبی نبیند.

مشاهده می شود که پرایمر upper در اینجا با GΔ منفی ،تشکیل لوپ نیز داده است.
بنابراین این پرایمر مناسب نیست و باید مجددا به جدول توالی برگشته و توالی جدیدی را انتخاب کنیم؛ تا زمانی که به پرایمر مناسب دست پیدا کنیم.

گزینه های دیگری که می توان بررسی کرد آنالیز است؛ مثلا ساختارهای ثانویه مثل Duplexes را بررسی کرد؛ هرچه این ساختارها بیشتر باشند پرایمر طراحی شده بدتر است. در زیر داپلکسهای ایجادی برای پرایمرهای طراحی کرده برای ژن P53 را مشاهده می کنیم.

نکته: توجه داریم که میتوان توالی اسید آمینه ها را با توجه به توالی های پیشنهادی (شکل بالا)در اینجا برای مثال اسید آمینه Threonine تغییر داده و پارامتر های پرایمر را به پارامتر های مطلوب و مورد نظر خود نزدیک سازیم.

همچنین می توان کامپوزیشن های پرایمرها را نیز در آنالیز بررسی کرد؛ بهتر است نسبت های G-C در آن بالا باشد.

• روش دیگر طراحی پرایمر ، این است که بخشی از توالی را به دلخواه در بخش Edit کپی کنیم و سایر موارد را در مورد آن اجرا کنیم. به طور مثال پرایمر زیر با 19 نوکلئوتید: