مقدمه ای بر فلوسیتومتری (flow cytometry)

فلوسایتومتری روش دستگاهی بسیار سریع و قدرتمندی است که برای شناسایی ذرات (سلول‌ها) و ارزیابی خصوصیات آنها به کار می‌رود. ذرات مورد آزمایش به صورت معلق در مایع با سرعتی حدود ۵ تا ۵۰ متر در ثانیه از میان منفذی باریک و از مقابل پرتوی باریک از نور لیزر عبور می‌کنند بدین ترتیب امکان جمع‌آوری اطلاعات مربوط به ۵۰۰۰ تا ۵۰۰۰۰ سلول در هر ثانیه فراهم می‌شود.   

  غالبا حجم مورد نیاز از نمونه مورد آزمایش نیز خیلی کم و حدود ۱۰۰ میکرولیتر می‌باشد. در مورد دقت آن نیز باید گفت که قادر است تعداد ۱ سلول سرطانی در میان ۱۰۰۰۰ تا ۱۰۰۰۰۰ سلول عادی موجود در نمونه مغز استخوان را شناسایی کند. فلوسایتومتری در بخش‌های تحقیقاتی و در آزمایشگاه‌های تشخیصی کاربرد وسیعی دارد و برای تشخیص بیماری‌ها، تعیین پیش آگهی و هم برای ارزیابی درمان بدخیمی‌ها کاربرد دارد.
این روش بر خصوصیات پراکنده سازی نور توسط سلول‌ها و نیز بر نشر فلورسانس از آنها استوار است. نشر فلورسانس می‏تواند با استفاده مستقیم از مواد رنگ‌کننده فلورسنت حاصل می‌شود (مثل رنگ کننده‌های DNA یا RNA که هم خصوصیت فلورسانس بودن را دارا هستند و هم خود انتخاب می‌کنند که به کدام جز سلولی متصل شوند) یا ترکیبی از رنگ فلورسنت با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال تحت نام عمومی کونژوگه مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این حالت انتخاب محل اتصال به سلول، توسط جزء آنتی‌بادی موجود در کونژوگه صورت می‌گیرد و این آنتی‌بادی است که به صورت کاملا اختصاصی آنتی‌ژن هدف را بر روی سلول یا در داخل آن شناسایی کرده و به آن متصل می‌شود و جزء فلورسنت موجود در کونژوگه ابزاری برای ردیابی محل و میزان آنتی‌بادی‌های متصل شده به هدف می‌باشد.
اگر چه سلول‌ها بخودی‌ خود دارای فلورسانس اندکی در برخی طول موج‌ها هستند اما بدون بکارگیری نور تهییج کننده که غالباً لیزر می‌باشد هیچ سیگنالی تولید و به ردیاب‌های دستگاه ارسال نخواهد کرد. سیگنال‌های ردیابی شده توسط دستگاه یا از منشاء نور لیزر دستگاه می‌باشد که پس از برخورد به سلول در جهات مستقیم (forward scatter) یا عمود بر محور تابش لیزر (side scatter) پراکنده شده و به ردیاب‌ها می‌رسد و یا از منشاء فلوروکروم متصل به سطح ذره می‌باشد. فلوروکروم‌های متصل شده به سطح یا داخل سلول بر اثر تابش نور لیزر تهییج شده و انرژی نور تابیده شده را جذب کرده و سپس در طول موج دیگری به صورت تابش فلورسانس آزاد می‌سازند.

سلول‌ها از اجزاء مختلفی مثل غشاء سیتوپلاسمی، غشاء هسته‌ای، هسته و سیتوپلاسم تشکیل می‌شود و تقریبا همه مولکول‌های موجود در قسمت‌های مختلف سلول را می‌توان با استفاده از فلوسایتومتری ردیابی و تعیین مقدار نمود. معمولاً مولکول‌های سطحی موجود در غشاء سیتوپلاسمی به راحتی در دسترس آنتی‌بادی قرار می‌گیرند ولی برای رسیدن آنتی‌بادی یا ماده فلورسانس به مولکول‌های درونی سلول روش‌های مطمئن و موثری لازم است.
هر سلولی بر حسب نوع و تخصصی که به عهده دارد مولکول‌های مختص به خود را بیان می‌کند، بدین معنی که همة ژن‌ها در همه سلول‌ها بیان نمی‌شوند بلکه برحسب وظیفه‌ای که در طی تمایز بر عهده سلول گذاشته شده است و بر حسب محیطی که در آن قرار می‌گیرد هر سلولی خود انتخاب می‌کند که در پاسخ به شرایط محیطی کدام ژن را فعال سازد. بنابر این ردیابی پروتئین‌های سلولی حاصل از بیان ژن‌ها هم در سطح و هم در درون سلول می‌تواند وسیله‌ای بسیار مفید برای شناسایی سلول باشد.
مولکول‌های سطحی سلول‌ها تحت نام عمومی CD که مخفف Cluster Differentiation می‌باشد شناخته می‌شوند و برای ردیابی آنها از آنتی‌بادی‌های منوکلونال کونژوگه با فلوروکروم استفاده می‌شود. مثلا مارکرهای سطحی سلولهای NK عبارتند از CD16 و CD56 که آنتی‌بادی‌هایی با همین نام قادرند این مولکول‌ها را در سطح سلول شناسایی نمایند. اغلب لفظ آنتی‌بادی در گفتار یا نوشتار حذف می‌شود مثلاً کونژوگه CD16 همان آنتی‌بادی شناسایی کننده CD16 می‌باشد که متصل به فلوروکروم است. یا کونژوگه CD34 اشاره به آنتی‌بادی شناسایی کنندة CD34 دارد که با فلوروکروم مناسبی کونژوگه شده است (CD34 مارکر اختصاصی سلول‌های ریشه‌ای تمایز نیافته مغز استخوان می‌باشد).
با استفاده از فلوسایتومتری محصولات پروتئینی ژن‌ها در داخل سلول نیز قابل ردیابی هستند و نامگذاری آنتی‌بادی‌های مورد استفاده براساس نام پروتئین مورد نظر صورت می‌گیرد. مثلاً پروتئین Zap-70 ساروگیت مارکر برای موتاسیون‌های ناحیه متغیر زنجیره سنگین ایمونوگلوبولین می‌باشد و در تعیین زیر گروه‌های CLL اهمیت دارد و توسط آنتی بادی با همین نام قابل شناسایی است.
فلوسایتومترهای اولیه قادر بودند فقط یک یا دو رنگ فلورسانس را تجزیه و تحلیل کنند اما امروزه دستگاه‌هایی عرضه شده‌اند که قادرند یازده رنگ فلورسانس را به طور هم‌زمان ردیابی و تجزیه و تحلیل کنند. اساس و نحوة کار فلوسایتومتر بحث پایه‌ای برای درک روش‌های مختلف فلوسایتومتری است.
برای انجام فلوسایتومتری لازم است که ابتدا سلول‌ها با فلوروکروم‌ها نشاندار شوند. از طرفی برای نشاندار کردن اجزاء داخلی سلول باید اقدامات خاصی را انجام داد تا آنها در دسترس آنتی‌بادی یا ماده فلورسنت قرار گیرند روش‌های رنگ‌آمیزی با فلوروکروم‌ها و استفاده از مواد نفوذپذیر کننده متنوع برای نفوذپذیر کردن سلول‌ها خود بحث دیگری است که باید جداگانه به آن پرداخته شود.
تعداد فلوروکروم‌های مورد استفاده برای فلوسایتومتری در طی سالیان متمادی مرتبا افزایش یافته است و این احتمال وجود دارد که در آینده، تعداد فلوروکروم‌های مورد استفاده برای آنالیز سلول‌ها بیش از این نیز افزایش یابد. شناخت انواع فلوروکروم‌ها و آگاهی از مزیت‌ها و معایب هر کدام تنها راه استفاده بهینه از آنها برای دستیابی به مقاصد علمی تحقیقاتی است.
برای انجام هر نوع فلوسایتومتری ابتدا باید سلول‌ها را آماده کرد به طوری که سلول‌ها به صورت تکی در آمده و در محیط مناسبی معلق شده باشند. بعضا یک مرحله تخلیص برای بالا بردن غلظت سلول‌های مورد نظر در نمونه ضرورت پیدا می‌کند روش‌های مختلفی برای تهیه، تخلیص و آماده سازی سلول وجود دارند و روش انتخاب شده به نوع سلول مورد ارزیابی بستگی دارد.
پس از تهیه سوسپانسیون مناسب، سلول‌ها باید با مواد فلورسانس رنگ شوند و یا با آنتی‌بادی‌های کونژوگه با فلوروکروم نشاندار شوند. روش نشاندارکردن تحت تاثیر فاکتورهای زیادی قرار می‌گیرد از جمله: میزان اختصاصی بودن آنتی‌بادی و غلظت آنتی‌ژن در سطح یا داخل سلول، مناسب بودن غلظت آنتی بادی مورد استفاده و به کار بردن کنترل‌های مثبت و منفی مناسب در آنالیز سلول‌ها.
داشتن برنامه‌های کنترل کیفی برای روش‌ها و تجهیزات در هر نوع فلوسایتومتری ضروری بوده و یک نیاز اساسی محسوب می‌گردد. این برنامه‌ها برای اطمینان از کیفیت نتایج بدست آمده به کار برده می‌شوند. همچنین برنامه‌های کنترل کیفی بایستی مرتبا و در حد کفایت انجام شوند تا تشخیص نقاط اشکال به آسانی ممکن گردد. بدین منظور، برنامة کنترل کیفی در هر دو زمینة، کنترل کیفی داخلی و روش‌های ارزیابی کیفی خارجی، باید به اجرا گذاشته شوند.
در فلوسایتومتری طی دو مرحلة جمع‌آوری اطلاعات و مرحلة آنالیز اطلاعات امکان خطا وجود دارد که با به کارگیری روش صحیح تهیة نمونه سلولی و تنظیم دقیق دستگاه می‌توان از خطاهای مربوط به مرحلة جمع‌آوری اطلاعات جلوگیری کرد اما توانایی اپراتور در طراحی صحیح آزمایش، تنها جنبه‌ای از کسب اطلاعات است که برای آن روش‌های کنترل خطا وجود ندارد. بدین معنی که انتخاب آنتی‌بادی مناسب و انتخاب فلوروکروم متناسب با غلظت و موقعیت آنتی‌ژن نیازمند تجربیات و اطلاعاتی است که باید توسط محقق کسب شوند.
آپوپتوز یکی از شکل‌های مرگ سلول می‌باشد که از نظر بیولوژی اهمیت زیادی دارد و به همین دلیل ردیابی و اندازه‌گیری آپوپتوز در تحقیقات و موارد بالینی اهمیت پیدا می‌کند. سلول‌های در حال آپوپتوز نشانه‌های زیادی دارند که قابل اندازه‌گیری با فلوسایتومتری می‌باشند این نشانه‌ها عبارتند از تغییرات در غشا پلاسمائی سلول، تغییرات در نفوذپذیری غشاء پلاسمائی، تغییرات در نفوذپذیری غشاء میتوکندری، فعال‌سازی کاسپازها و شکستگی‌های DNA سلولی. شناسایی هر یک از این تغییرات به تنهایی یا ترکیبی از آنها به وسیلة فلوسایتومتری، امکان شناسایی و اندازه‌گیری سلول‌های آپوپتوتیک را از میان مخلوطی از سلول‌های دیگر فراهم می‌کند همچنین اطلاعات با ارزشی در بارة مسیر مولکولی مرگ سلول‌ها به دست می‌آید.
دسترسی به رنگ‌های فلورسنتی که به صورت خطی و متناسب با غلظت به DNA سلولی متصل می شوند فلوسایتومتری را برای آنالیز DNA توانمند ساخته است. امروزه تعیین کمی مقدار DNA، شناسایی سلول‌های دیپلوئید نرمال در حالت استراحت، شناسایی سلول‌هایی که به طور فعال DNA سنتز می‌کنند و شناسایی سلول‌هایی که در مرحلة پیش میتوز و یا میتوز هستند توسط فلوسایتومتر امکان پذیر شده است. هنگامی که فازهای مختلف چرخة زندگی سلول‌ها مشخص شدند، می‌توان با توام‌ کردن روش‌های ردیابی پروتئین‌های مؤثر در چرخة سلولی به وسیلة آنتی‌بادی‌های اختصاصی و روش تعیین مقدار DNA بیان پروتئین‌ها را در فازهای مختلف زندگی سلول‌ها بررسی کرد. اضافه‌ نمودن آنالوگ تیمیدین یا برومو داکسی یوریدین به محیط کشت سلولی امکان شناسایی سلول‌هایی را فراهم می‌کند که فعالانه در حال سنتز DNA هستند. با استفاده از روش تعیین مقدار DNA همچنین می‌توان تعداد کروموزوم‌ها (هنجار یا ناهنجار) را مشخص کرد. سلول‌هایی که به حالت پلوئیدی (برای مثال در مگاکاریوسیت‌ها) و یا آناپلوئیدی (برای مثال در بیماری‌های بدخیم) می‌باشند نیز با این روش قابل شناسایی هستند.
روش فلوسایتومتری در سایة افزایش روز افزون تعداد آنتی‌بادی‌ها، تترامرها و رنگ‌های تولید شده برای استفاده در ارزیابی فعالیت سلول‌ها به عنوان یک ابزار مهم در مطالعة سلول‌های سیستم ایمنی در آمده است. فلوسایتومتری چند رنگی این امکان را فراهم آورده است که انواع سلول‌های موجود در نمونة خون یا سلول‌های کشت شده به تفکیک مورد ارزیابی قرار گیرند. سلول‌های تحت مطالعه با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی معرف زیر گروه‌های سلولی، شناسایی می‌شوند و خصوصیات رفتاری آنها نیز با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی (مثلاً ضد سایتوکین) و یا رنگ‌های ارزیابی کننده حیات سلولی تعیین می‌شوند. با استفاده هم‌ زمان از دو روش آنالیز سلولی و جداساز سلولی (cellsorter) امکان مطالعه بیشتر و کشت سلول‌های کاملا شناخته شده از نظر فنوتایپی یا رفتاری فراهم می‌گردد.
در حضور یون‌های کلسیم خصوصیات طیفی برخی از رنگ‌های فلورسنت تغییر می‏یابد. از این رنگ‌ها برای اندازه‌گیری تغییرات غلظت کلسیم اجزا سلولی در هنگامی ‌که سلول‌ها بوسیله انواع محرک‌ها تحریک می‌شوند استفاده می‌شود.
بیشترین مورد استفاده از فلوسایتومتری ارزیابی آنتی‌ژن‌های سطحی بیان‌شده بر روی سلول‌ها می‌باشد. اما علاوه بر آن سلول‌ها ممکن است با روش‌های مختلف برای اندازه‌گیری خصوصیات عملکردی بوسیله فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گیرند. می‌توان تغییرات زمانی بیان گیرنده‌ها را تعیین کرد یا برهمکنش یک نوع سلول را با سلول دیگر اندازه‌گیری نمود. بعلاوه، امکان ارزیابی تغییرات در فعالیت آنزیم‌ها و پتانسیل غشایی وجود دارد. همچنین می‌توان آزمایشاتی برای نشان دادن فاگوسیتوز و آزادسازی مولکول‌های فعال زیستی (bioactive) انجام داد.
روش جداسازی سلول‌ها با استفاده از خصوصیات فلورسانس آنها توسط ایمونولوژیست‌هایی ابداع شد که تلاش می‌کردند جمعیت‌های خالص سلول‌ها را از نمونه‌های مختلط تهیه کرده و پس از تکثیر آنها در محیط کشت سلولی، نقش مجزای هر سلول را در سیستم ایمنی بررسی نمایند. روشی که آنها به کار بردند Fluorescence Activated Cell Sorting یا به طور خلاصه FACS نامیده شد. جداسازهای جریانی (flowsorter) وسایلی ضروری و پرطرفدار در علوم بیولوژیکی و علوم دیگر هستند. کارآیی اصلی این جداسازها، چنانچه از نامشان بر می‌آید، جدا کردن جمعیت‌های سلولی دلخواه از میان جمعیتی هتروژن از سلول‌ها برای مطالعة بیشتر می‌باشد. بطور کلی اگر سلول یا ذره‌ای دارای خصوصیات منحصر به فردی از نظر فیزیکی یا شیمیایی باشد با استفاده از آن خصوصیات می‌توان براحتی آن را شناسایی کرده و توسط flow sorter از دیگر سلول‌های همراه جدا کرد.

مبحث مهم دیگر نرم افزارهای مورد استفاده در فلوسایتومتری هستند. در اوایل، دستگاه‌های فلوسایتومتر اطلاعات سلولی جمع‌آوری شده توسط دستگاه را با فرمت خاصی ذخیره می‌کردند که استفاده مجدد از اطلاعات ذخیره شده در کامپیوترهای معمولی (PC) غیرممکن می‌شد، اما امروزه نسل سوم استانداردهای فایل فلوسایتومتری (FCS3) تنظیم و تصویب شده است و رعایت این استانداردها توسط تولید کنندگان دستگاه‌ها سبب شده است تا فایل‌های اطلاعات ذخیره شده فلوسایتومتری کاربرد عمومی‌تری پیدا کند. نرم افزارهای مورد استفاده می‌توانند برای جمع‌آوری اطلاعات و پردازش آنها، ترسیم نمودارهای یک، دو یا سه بعدی از اطلاعات و یا برای انجام محاسبات ریاضی و آماری بر روی اطلاعات به کار برده شوند. معرفی انواع نرم افزارهای رایج برای باز کردن و مدیریت فایل‌های فلوسایتومتری و محاسن و محدودیت‌های هر کدام نیازمند مجالی دیگر است.