تراریختی گیاهان بواسطه آگروباکتریوم

طبقه بندی اولیه ­ی آگروباکتریوم بر اساس ویژگی­ های بیماریزایی­ شان صورت گرفت. به همین خاطر نژادهایی که باعث ایجاد گال قهوه ­ای ساقه می­شدند به عنوان Agrobacterium tumefaciencs، نژادهایی که ایجاد  گال در تمشک می­کردند A.rubi، آن­هایی که ریشه مویی را القا می­کردند در گروه A. rhizogenes طبقه بندی و نژادهایی که عمل بیماریزایی را ایجاد نمی­کردند نیز تحت عنوان A. radiobacter نامیده شدند. بعدا نژادها بر اساس ویژگی­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که داشتند طبقه ­­بندی شدند. 

 

مراحل آلودگی:

در طی فرآیند آلودگی قطعاتی از پلاسمید Ti که T-DNA نامیده می­شود از آگروباکتریوم به هسته سلول گیاهی منتقل شده و سپس بدرون DNA کروموزومی وارد و بیان می­شود. دشه مویی نیز به چنین روش مشابهی ریشه ­زایی را القا می­کند البته در آنجا پلاسمید Ri به جای Ti وجود دارد. انتقال T-DNA و فرآیند انتقال شامل تعداد زیادی از فاکتورهای باکتریایی و میزبان است که در نهایت منجر به ایجاد سلول­های گیاهی تراریخته می­شود.

در طی فرآیند آلودگی، آگروباکتری مکانیسسم دفاع گیاهی را از طریق کد کننده کروموزومی تجزیه پر اکسید هیدروژن بوسیله­ی نقش­های مرتبط با پلاسمید Ti، متوقف می­کنند. تراریختی سلول­های گیاهی منجر به افزایش تولید هورمون و نیز افزایش حساسیت می­شود که هر دوی این عوامل تکثیر غیر طبیعی را هدف قرار داده و منجر به رشد توموری یا ریشه­زایی غیر معمول می­شود. تومورها و ریشه­های مویی تولید و ترشح اسیدهای آمینه خاص و مشتقات معروف به اپین­ها را تحریک می­کنند. این اپین­ها به عنوان مواد غذایی انتخابی برای القای باکتری و ممانعت از هم یوغی پلاسمید Ti/Ri شان عمل می­کند. اگرچه اپین­ها به عنوان مواد غذایی فوق العاده اختصاصی عمل می­کنند اما می­توانند به وسیله­ی سایر میکروبها مثل پزودوموناس و برخی از قارچ­ها مثل فوزاریوم نیز استفاده می­شوند.

گستره ­ی میزبانی آگروباکتریوم:

گال قهوه­ای از روی حدود 40 گیاه مهم و اقتصادی یافت شده است. آلودگی می­تواند هم از طریق خاک و هم از طریق مواد گیاهی آلوده منتقل شود. در طی قرن بیستم به عنوان بیماری باکتریایی اصلی در کشت گیاهان بوده است اگرچه در برخی موارد مثل درخت گیلاس اثرات مضری مشاهده نشده است. خسارت حاصله از گال قهوه­ای عمدتا در اقلیم­های سرد جدی­تر است و به طور متناوب منجر به کاهش محصول گیاهان آلوده می­شود. به طور اندکی اثر بیماری ریشه­زایی بر روی گیاهان آلوده مشخص می­شود. برخی مدارکی مبنی بر این ارائه کرده­اند که شکل گیری ریشه­های ثانویه بوسیله­ی A. rhizogenes می­تواند اثرات مفیدی بر روی گیاهان آلوده داشته باشد. درختان آلوده­ی زیتون و بادام سرعت رشد بهتری را نشان داده و شرایط خشکی را بهتر تحمل کرده و عملکرد بیشتری نسبت به گیاهان غیر آلوده می­دهند.

محدوده­ی میزبانی آگروباکتریوم بوسیله­ی فاکتور­های گیاهی و باکتریای تعیین می­شود که برای باکتری ژن­های بیماریزایی باکتری و از گیاه ژن­های مورد نیاز برای شکل­گیری تومور و تراریختی لازم است. پشت این فاکتورهای ژنتیکی نوع بافت و وضعیت فیزیولوژیکی گیاه ممکن است در تراریختی کارآ و شکل گیری تومور موثر باشد برای مثال تک لپه­ایها به عنوان گیاهان غیر میزبان شناخته شده­اند اما سلول­های مریستمیک چندین تک لپه­ای با موفقیت تحت شرایط آزمایشگاهی تراریخت شده­اند. تنوع ژنتیکی پاتوژن و پتانسیل میزبان آن منجر به تعیین الگوهای محدوده­ی میزبانی متفاوت بیشتری می­شود.

اگرچه در ابتدا شناسایی میزبانان A.tumefaciens/rhizogenes از طریق بررسی ظهور علایم بعد از آلودگی صورت می­گرفت اما بعدا مشخص شد که آگروباکتریوم طیف وسیعی از گیاهان را بدون ظهور علایم آلودگی تراریخت می­کند. این مدارک در ابتدا از آنالیز اپین کالوس­های شکل گرفته در زخم­های تلقیح شده در تک لپه­ایها و دو لپه­ایهای غیر میزبان بدست آمد. با استفاده از روش اینفیلتراسیون، زن­های ویروسی گیاهی کلون شده در T-DNA توانست به ذرت و گندم و برنج که هر سه جزو گیاهان غیر میزبان هستند، منتقل شود. متعاقب آن نوترکیبی ژنتیکی در مخمر، قارچ و سلول­های انسانی با آگروباکتریوم صورت گرفت. 

با اثبات اینکه A. tumefaciens می­تواند برای تراریختی در گیاهان استفاده شود، انقلابی در عرصه­ی کشاورزی و تحقسقات بیولوژی مولکولی گیاهان رخ داد. تراریختی در گیاهان نه تنها نیازمند پیک و ادغام DNA مهندسی شده بدرون سلول­های گیاهی بوده بلکه نیازمند باززایی گیاهان تراریخت از سلول­هایی که نوترکیب شده­اند، می­باشد. به همین خاطر اولین تراریختی­ها در میزبانان طبیعی آگروباکتریوم (تنباکو، گل اطلسی، هویج و آفتابگردان) که هم میزبانان طبیعی بودند و هم پروتکل باززایی آنان از سلول­های منفرد در دست بود، صورت گرفت. حقیقتا تکنولوژی کشت بافت گیاهی به وفور عامل محدودکننده­تری نسبت به خود فرآیند تراریختی برای حصول تغییرات ژنتیکی کارآ بوده است. با آزمایشات گسترده­ای که صورت گرفته، پروتکل­های تراریختی بواسطه­ی آگروباکتریوم و باززایی بسیاری از گیاهان میزبان شامل پنبه، سویا، چغندرقند، سویا، جو و موز تهیه شده است. درر ابتدا عقیده بر این بود که تولید تک لپه­ایهای نوترکیب با استفاده از آگروباکتریوم غیرممکن است اما امروزه این عمل برای کولتیوارهای خاصی از برخی تک لپه­ایها متداول شده است. به هر حال تراریختی چندین غله مهم از لحاظ زراعی هنوز دارای مشکلات زیادی است و هنوز نیازمند تحقیقات بیشتر روی آنان است.

نیازمندیها برای تکثیر گیاهان تراریخت

به طور کلی مشخص شده است که نوترکیبی به واسطه­ی آگروباکتریوم شامل مایه کوبی سلول­ها با باکتری­هایی گه ژن­های خارجی در سازه­ی آن­ها در نواحی کناری توالی مرزی آن­ها وارد شده است، می­باشد. سلول­های گیاهی که DNA خارجی در ژنوم آن­ها وارد شده از طریق فاز کالوس­دهی قبل از باززایی گیاهان تراریخت انتخاب و تکثیر می­شود. در بیش از دو دهه، تعدادی تکنیک برای افزایش کارایی انتقال ژن به وسیله­ی آگروباکتریوم گسترش یافته است. زخم کردن بافت گیاهی بوسیله­ی سونیکاسیون کشت سوسپانسیون جنینی، ذرات شیشه، بمباران ذرات، بنباران با ریز پرتابه­های پوشیده شده با آگروباکتریوم و یا جذب در بذور در حال جوانه­زنی باعث موفقیت در حداقل یک گونه گیاهی شده است. توتی پوتنسی سلول­های گیاهی، تراریختی در انواع مختلف سلول­های گیاهی را ممکن ساخته است. اگر چه بافت­های مختلف از گونه­های مختلف پاسخ­های متفاوتی به شرایط کشت می­دهند بنابراین بهینه کردن کشت و روش باززایی برای هر بافت میزبان و گونه­ی آن بایستی صورت پذیرد. ریزنمونه­ها اغلب به عنوان هدف برای تراریختی استفاده می­شوند زیرا تمایل کمتری به ایجاد تغییرات در وضعیت متیلاسیون DNA، بازچینی کروموزومی، و دیگر تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی که در کشت بافت اتفاق می­افتد و منجر به تنوع سوماکلونی می­شود از خود نشان می­دهند. باززایی القاء شده بوسیله هورمون در گیاهان تراریخت از ریزنمونه­های تراریخت می­تواند از طریق اندام­زایی( شکل گیری مستقیم ساقه) یا جنین­زایی سوماتیکی (تکثیر جنین­هایی که می­توانند مستقیما از بافت­های سوماتیکی بوجود آمده و گیاهچه تولید کنند) صورت پذیرد. بیشتر گیاهان مهم و اقتصادی بویژه تک لپه­ایها با استفاده از رویکرد دومی بازا می­شوند. در این گیاهان کالوس دهی از اسکوتلوم جنین­های نارس به سادگی آغاز می­شود. انتقال مستقیم DNA خارجی بدرون بافت مرستمی یا جنین­های نارس تنوع سوماکلونی را محدود می­کند زیرا این بافت­ها زمان کشت بافت را به حداقل می­رسانند. روش اینفیلتراسیون در خلا برای گل کامل آرابیدوپسیس برای اجتناب از کشت بافت و باززایی ان توسعه یافته است. در فرآیند غرق کردن گل تنها بافت نمو یافته­ی گل در درون محلول سلول­های آگروباکتری غوطه ور می­شود و مرحله­ی اینفیلتراسیون در خلا حذف می­شود.

علاوه بر مستعد بودن به آلودگی با آگروباکتریوم و توانایی باززایی کل گیاه از سلول­های تراریخت، سومین نیازمندی برای تغییر ژنتیکی موفق، روش انتخاب کارآ  در مورد سلول­های حاوی DNA خارجی است. در اولین آزمایشات تشخیص سلول­های تراریخت بوسیله­ی غربال برای تولید نوپالین صورت گرفت. به طور همزمان با این کارها مقالات دیگری که کلید بهبود آغاز سیستم تراریختی بود منتشر شد. در میان این مقالات مهمترین آن­ها استفاده از پروموتورهای رسیده از T-DNA و منطقه­ی تنظیمی /3 (از ژن نوپالین سنتاز) که رونوشت ژن مقاومت به آنتی بیوتیک مانند کلرامفنیکل استیل ترانسفراز یا نئوماسین فسفوترانسفراز (nptII) را در گیاه تحریک می­کرد. بیان این ژن­های شیمریک در گیاه انتخاب سلول­های گیاهی نوترکیب مقاوم به آنتی بیوتیک را ممکن ساخت و همین طور حذف ژن اپین سنتاز از DNA منتقل شده امکان پذیر شد. گیاه بارور و نرمال از سلول­های مقاوم بازا شد و صفت مقاومت بوسیله­ی روش­های مندلی به نتاج منتقل گردید. دو نوآوری در طراحی وکتور سختی­های مرتبط با کلونینگ بدرون پلاسمیدهای Ti خیلی بزرگ را برطرف کرد. زمبراسکی و همکاران کل منطقه­ی ایجاد گال پلاسمید Ti را با وکتور کلونینگ استاندارد pBR322 جایگزین کردند. توالی­های DNA مورد نظر به آسانی می­توانند در درون وکتور pBR کلون شده و سپس با یک نوترکیبی  ساده می­توانند وارد منطقه­ی T شوند.

کشت و نگهداری نژادهای آگروباکتریوم

بیشتر نژادهای آگروباکتریوم به عنوان یک باکتری هوازی و شیموارگانوتروف در محدوده­ی وسیعی از محیطهای کشت مشخص و نامشخص رشد می­کند. روش­های رایج مورد استفاده برای کشت و ذخیره سازی دیگر باکتریهای شیموارگانوتروف معمولاً برای این باکتری نیز مناسب است. در اینجا تعداد از محیطهای کشت مشخص و نامشخص که به طور موفقیت آمیزی در کشت آگروباکتریوم شامل برخی از محیطهای نیمه انتخابی باکتری صحت می­شود. در ادامه نیز مطالبی در مورد روشهای مناسب برای نگهداری کوتاه مدت و طولانی مدت سویه­های آگروباکتری صحبت می­شود.

بیشتر سویه­های Agrobacterium tumefacienns و سویه­های خویشاوند نزدیک به آن مثل A. radiobacter قادر به رشد در محیط حداقل با نمک و یک منبع کربن هستند. A. rhizogenes ، A.rubi و برخی از ایزوله­های دیگر آگزوتروف قادر به رشد در این محیط­های رشد حداقل نبوده و نیاز به اضافه کردن فاکتورهای رشدی مثل بیوتین، پانتوتنات و ... هستند. منابع کربنی که به راحتی قابل استفاده نیستند مثل نشاسته و سلولز توسط برخی از اعضای این جنس مصرف می­شوند. نمکهای نیترات و آمونیوم منابع نیتروژنی مناسبی برایA.tumefaciense و A.radiobacter است در حالیکه برای A.rubi  و A.rihzogenes این گونه نیست.

روش­های متعددی برای ذخیره­سازی باکتریها وجود دارد که اغلب آنها برای نگهداری آگروباکتریوم مناسب است. نکته مهم این است که روشی باید انتخاب شود که در آن قدرت زنده ماندن، تعداد و ثبات ژنتیکی جمعیت­های ذخیره شده باکتری بعد از اتمام دوره نگهداری بالا باشد. در اینجا سه روش مناسب برای ذخیره سازی کوتاه مدت و(3 ماه) و بلند مدت آگروباکتری شرح داده می­شود. این روشها شامل نگهداری در کشت stab، خشک کردن برروی ورمیکولیت و فریزکردن در دمای پائین است.

کشت stab، روش ارزان وساده ای برای نگهداری سویه­های آگروباکتری با انتقال به محیطهای تازه در فواصل زمانی منظم است. اگر کسی چند کشت برای نگه­داری داشته اشد، این روش می­تواند بهترین انتخاب باشد. چون خطر تغییرات ژنتیکی از طریق انتخاب موتانت و از دست دادن پلاسمید وجود ندارد. اگرچه احتمال آلودگی در خلال انتقال­های متعدد وجود دارد.

روش ارزان و ساده­­ی دیگر برای ذخیره سازی سویه­های باکتری، خشک کردن باکتری در یک محیط محافظتی است. پسنی و همکاران دریافتند که 80% میزان ماندگاری برای A.radiobacter سیزده ماه بعد از مایه کوبی با ورمی کولیت استریل و ذخیره­سازی در 4 درجه سانتی گراد وجود دارد. در آن مطالعه هدف نویسندگان تعیین روشی برای محافظت از سویه­های فعال به صورت بیولوژیکی برای هدفهای تجاری بود.

در آزمایشگاه­های با تعداد زیاد سویه، بهترین روش نگهداری بلند مدت باکتری، فریزکردن محیط­های کشت کوچک در 80- و 70- است. فریز کردن یک سویه امکان تغییرات ژنتیکی را بالا می­برد و بعد از ذخیره سازی نیازمند روشهای جابه­جایی نیست. اما باید به مسئله قیمت فریزرهای با دمای پائین و همچنین مدیریت آن مثل نظم در قرار دادن مواد و همچنین محافظت علیه مواردی که باعث تخریب یخچال می­شود، ضروری است.

انواع محیط­های کشت باکتری:

الف) محیطهای کشت نامشخص:

1)      محیط مانیتول مخمر: که حاوی 10 g/L mannitol, 1 g/L yeast extract, 0.5 g/L K2HPO4, 0.2 g/L CaCl2, 0.2 g/L NaCl, 0.2 g/L MgSO4·7H2O, 10 mg/L FeCl3.   در هر لیتر و با PH=7 تهیه می­گردد.

2)      محیط غذایی مخمر: که حاوی 8 g/L nutrient broth powder, 2 g/L yeast extract می­باشد

3)      محیط YDPC که حاوی 4 g/L peptone, 4 g/L yeast extract, 5 g/L (NH4)2SO4, 10 g/L CaCO3, glucose (20% solution). می­باشد( با PH=7).

4)      محیط MG/L که حاوی 5 g/L tryptone, 2.5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 5 g/L mannitol, 0.1 g/L MgSO4·7H2O, 0.25 g/L K2HPO4, 1.2 g/L L-glutamate, thiamine (10% solusolution, در PH=7 در هر لیتر می­باشد.

5)      محیط LB که از مخلوط این مواد در هر لیتر و در PH=7 حاصل می­شود. 10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g/L yeast extract

6)      محیط YEB که در هر لیتر آن در PH=7 این مواد اضافه می­شود. 5 g/L tryptone, 1 g/L yeast extract, 5 g/L nutrient broth, 5 g/L sucrose, 0.49 g/L MgSO4·7H2O.

ب) محیطهای کشت مشخص

معمولا از این محیط های کشت بدلیل وقتگیر بودن و مزایای محیهای کشت نامشخص کمتر استفاده می­شود. رایجترین این محیطها محیط AB* است. که بسیار شبیه محیط کشت MS بوده با این تفاوت که در این محیط کشت از بافر مخصوص و درصدهای متفاوتی از این نمک­ها استفاده می­شود.

نکته مهم در مورد ساخت محیط کشت باکتری این است که اگر محیط کشت برای القای ژن vir ساخته می­شود مواد القا کننده فنولی مثل DMSO و acetosyringone به محیط کشت اضافه شود.

نکته دیگر این است که به طور معمول PH محیط کشت را بین 6.8-7.2 می­گیرند اما بهتر است در محیطهای کشتی که القای ژن vir صورت بگیرد اندکی محیط کشت اسیدی باشد. از طرف دیگر دمای محیط کشت برای هر دو حالت که هدف القای ژن vir هست/نیست دمای محیط 25-30 در نظر گرفته می­شود.

آنتی بیوتیکهای انتخابی درمحیط کشت

معمولا از آنتی بیوتیک­های زیر و با غلظت­های داده شده استفاده می­شود.

 وکتورهای دوگانه ابزار بسیار مناسبی در نوترکیبی گیاهان عالی بوسیله­ی A.tumefaciens هستند.این وکتورها از T-DNA، اماکن­های برشی چندگانه، اجزای همانند سازی در E.coli و A.tumefaciens ، ژن­های نشانگر، ژن­های گزارشگر و دیگر اجزای فرعی که کارآیی و ظرفیت انتقال را بالا می­برند، تشکیل شده است. وکتورهای فوق دوگانه علاوه بر حمل ژن­ها بیماریزایی از پلاسمید Ti، فراوانی بسیار زیاد نوترکیبی را نشان می­دهند که این مسئله برای گیاهانی که به سختی نوترکیب می­شوند مثل غلات بسیار ارزشمند است. وکتورها عمدتا به شکل حلقوی هستند. بهترین کارایی یک وکتور دو گانه هنگامی است که قطعه ورودی کمتر از 15 کیلوباز باشد. در این حالت نشانگر انتخاب سازگار و مکان­های برشی مناسب خواهند بود. گرچه هنگامیکه طول قطعات بزرگتر از 15کیلوباز می­شود، ظرفیت نگهداری قطعات از اهمیت بالاتری برخوردار است.چون هیچ وکتوری برای همه­ی پروژه­ها کامل نیست، پیشنهاد می­شود که تغییر وکتور و طراحی سازه­ی جدید باید با توجه به موضوع آزمایشات باشد.

در زیر یک نمونه از وکتورهای دوگانه رایج در کارهای مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی آورده شده است. این وکتور دوگانه به نام pBI121 نامگذاری شده است.

سه روش برای ورود DNA خارجی به درون آگروباکتری

دستکاری ژنتیکی A. tumefaciens برای تسهیل کردن مطالعات نقش­های ژن­های باکتریایی استفاده می­شود. همچنین این دستکاری­ها به عنوان اولین مرحله در ورود مواد ژنتیکی به درون سلول­های گیاهی با قابلیت تراریختی از طریق استفاده از وکتورهای ثانویه T-DNA است. به طور معمول سه روش برای تراریختی استفاده می­شود. این سه روش شامل الکتروپوریشن، روش freeze/thaw و  روش آمیزش سه والدینی است.

کاراترین روش قرار دادن DNA خارجی درون آگروباکتری روش الکتروپوریشن است. این روش وابسته به استفاده از شوک­های الکتریکی برای ایجاد منافذ به اندازه کافی بزرگ هستند که به مولکول­های DNA و یا دیگر ماکرومولکول­ها اجازه ورود به سلول را دهند. در چنین زمانی، احیای تراریخت­ها بستگی به ظرفیت غشا برای بازسازی و قدرت سلول­ها را برای زنده ماندن پس از شوک دارد. موفقیت در این روش وابسته به تنظیم قدرت پالس­ها و زمان آن­ها دارد. سلول­های مستعد با شستشوی کامل و حذف الکترولیت­ها تهیه می­شوند و نیز DNA باید در یک محلول بدون نمک باشد. الکتروپوریشن مکانیزم با کارآیی بالای تراریختی است که می­تواند منجر به ایجاد بیش از 106 تراریخت به اضای هر میکروگرم پلاسمید حلقوی شود. مشاهده شده که کارآیی تراریختی با پلاسمیدهای بزرگ کاهش می­یابد اما الکتروپوریشن به طور موفقیت آمیزی برای ورود پلاسمیدهایی به بزرگی kb200 به درون آگروباکتریوم استفاده شده است. این تکنیک برای استفاده در ساخت کتابخانه­های ژنومی بسیار کاراست و حتی هنگامیکه ساختمان سویه وابسته به جذب و ادغام DNA خطی یا غیر همانند ساز است، استفاده می­شود.

هنگامیکه DNA پلاسمیدی خالص شده در دسترس است، روش سریع و آسان به عنوان جایگزین الکتروپوریشن روش ذوب و یخ کردن متوالی است. مکانیزم دقیق این روش به خوبی شناخته شده نیست. احتمالا جذب DNA وابسته به تخریب دیواره سلولی بوسیله در معرض نهادن کاتیون دو ظرفیتی و تغییرات سریع دمایی است که سیالیت غشای سلولی را تغییر می­دهد. تراریختی با این روش حدود 100-1000 سلول نوترکیب در هر میکروگرم DNA است که این مقدار چندین مرتبه کوچکتر از مقدار تراریختی با روش الکتروپوریشن است. به هر حال کارآیی تراریختی بالا انتظار اولیه ما نیست(وقتی که حرکت یک سازه از E.coli به آگروباکتریوم هدف باشد). این روش نیاز به داشتن ابزار و ماشین آلات تخصصی ندارد.

روش آمیزش سه والدی روشی کارا برای جا­به­جایی پلاسمیدهای غیر الحاقی و قابل تجهیز بدرون باکتری است. در این روش از دو سویه E.coliبرای انتقال پلاسمید به آگروباکتریوم استفاده می­شود. سویه اول E.coli حاوی یک پلاسمید قابل انتقال است. این پلاسمید تمام پروتئین­های کمک کننده برای شکل­گیری یک پل جنسی را کد می­کند. این پروتئین­ها در انتقال خود پلاسمید و همچنین پلاسمیدهای دستکاری شده دیگر به درون سلول­های گیرنده به کار می­روند. حرکت پلاسمید کمک کننده به درون دومین سویه­ی E.coli (سویه دهنده) که حاوی ژن­های مورد نظر برای انتقال به آگروباکتریوم است، می­باشد. نقش پلاسمید کمک کننده در انتقال پلاسمید سویه­ی دوم به سلول­های گیرنده آگروباکتریوم بسیار فراوان است. این نقش­ها شامل ایجاد شکاف تک رشته­ای در منطقه­ی oriT (مبدا انتقال) و نشاندارکردن DNA شکسته به سمت پل آمیزشی که باعث ارتباط بین سلول­های گیرنده و دهنده می­شود.

در حقیقت قابلیت انتقال پلاسمید مهندسی شده از پلاسمید سلول A به B بخشیده شده و سپس پلاسمید مهندسی شده به سلول­های قابل امتزاج با آگروباکتریوم فرستاده می­شود(D) و در نهایت انتقال به آگروباکتریوم صورت می­گیرد.

انتقال ژن­ها به درون کروموزوم­های آگروباکتریوم تومفاسینس

به علت این­که A. tumefaciens به طور وسیعی در پروژه­های تراریختی به کار می­رود محققان تمایل دارند که بیش از یک ژن را در درون آن جای دهند. به طوری که نقش­های یاکتریایی متعددی را در طی نوترکیبی ژنتیکی گیاه دستکاری کنند. این ژن­ها به تناوب بوسیله­ی پلاسمید­های چندگانه به درون آگروباکتریوم آورده می­شوند. این مسئله مشکل است که چندین پلاسمید را در یک باکتریوم بدون استفاده از طیف گوناگونی از آنتی­بیوتیک­ها نگه داشت. به هر حال استفاده از برخی آنتی بیوتیک­ها برای سویه­های A. tumefaciens مناسب نیست. همچنین کاربرد آنتی بیوتیک­های زیاد در محیط کشت منجر به کاهش کاهش رشد A. tumefaciens می­شود. بنابراین یکی از روش­ها قراردادن  ژن­های مورد نظر به درون کروموزوم باکتریایی برای حذف استفاده از چندین آنتی­بیوتیک در طی رشد باکتری است. در زیر به طور شماتیک در سویه­ی C58 ژن مورد نظر به درون لوکوس pgl/plcA در کروموزوم A. tumefaciens وارد می­شود. ژن وارد شده در یک کپی در هر سلول پایداری نشان می­دهد.

همانطور که در شکل مشاهده می­شود، در این نوع انتقال نوترکیبی عامل ورود یک قطعه DNA به درون کروموزوم باکتریایی است. مشابه این نوع انتقال در انتقال ژن به کلروپلاست گیاهی دیده می­شود.

القای ژن­های بیماریزایی آگروباکتریوم تومفاسینس

توانایی A. tumefaciens برای تراریختی گیاهان و دیگر موجودات شدیداً تحت کنترل ژنتیکی تنظیم می­شود. دو پروتئین بیماریزای virA و virG به عنوان یک سیستم تنظیمی دو جزئی برای درک ترکیبات فنولی سنتز شده بوسیله­ی بافت­های زخمی گیاه عمل می­کنند. القا بوسیله­ی این ترکیبات فنولی در حضور مواد غذایی ویژه یا قند اسیدها منجر به فعال شدن دیگر ژن­های vir شده و منجر به فرآوری T-DNA  از پلاسمید Ti و در نهایت انتقال T-DNA به سلول­های گیرنده میزبان می­شود. برخی از گونه­های گیاهی و اکثر کونه­های غیر گیاهی مقادیر کافی از ترکیبات فنولی مناسب برای این­که انتقال ژنتیکی بوسیله­ی اگروباکتریوم صورت گیرد، تولید نمی­کنند. در طی تراریخت کردن این گونه­ها، ترکیبات القاء کننده­ی فنولی باید قبل و یا در طی هم­کشتی سلول­های گیرنده با باکتری اضافه شود.

روش تراریختی آرابیدوپسیس با غوطه ­ور کردن گل

 روش تراریختی با غوطه­ور کردن گل از چند جهت قابل توجه است. اول، انجام دادن این روش ساده است. اگروباکتریوم در گیاهان آرابیدوپسیسی که در حال گلدهی هستند به کار می­رود که متعاقباً این گیاهان تولید بذر کرده و گیاهان تراریخت از میان گیاهچه­های حاصل از کشت این بذور به دست می آید. چون در این روش نیازی به کشت بافت نیست در نتیجه تنوع سوماکلونی دیده نمی­شود. روش کار توسط یک غیز متخصص به سادگی انجام می­شوود. درجه موفقیت این روش زیاد است به طورری که معمولا ً1% گیاهچه­ها، نوترکیب هستند. بیولوژی پشت این روش جالب است. ظاهراً آرابیدوپسیس و برخی از افراد خانواده Brassicacea در اجازه به کاربرد خارجی آگروباکتریوم برای ساکن شدن در درون تخمدان­های در حال نمو جایی که سلول­ گامتوفیت مادری نوترکیب می­شود، به صورت منحصر به فرد عمل می­کند. دسترسی به این روش اثر دگرگون کننده­ای در تمام فعالیت­های بیولوژی مولکولی گیاه داشته است. به طوریکه تولید و آنالیز تعداد زیادی از گیاهان تراریخت اکنون به طور متداول در صدها آزمایشگاه در حال انجام است. این روش در کارهای ژنومیکسی برای تهیه­ی لینه­های گیاهی با ژن­های غیر فعال شده­ی پایدار برای بیشتر ژن­های آرابیدوپسیس استفاده شده است.

اجزای اصلی برای توسعه گیاهی

اجزای اصلی برای توسعه­ی گیاهان تراریخت شامل 1- توسعه­ی سیستم بازایی کشت بافت که قابل اعتماد باشد.2- تهیه­ی سازه­ی ژنی و تراریختی با وکتور مناسب3- تکنیک­های کارای تراریختی برای ورود ژنها به درون گیاهان زراعی 4-احیا و تکثیر گیاهان تراریخت 5-مشخصات ژنتیکی و مولکولی گیاهان تراریخت برای بیان پایدار و کارای ژن 6-انتقال ژن ها به ارقام ممتاز بوسیله­ی روش­های متداول اصلاحی (در صورت نیاز)7- ارزیابی گیاهان تراریخت برای تاثیرشان در کاهش تنش­های زنده و غیر زنده بدون داشتن خطرات زیست محیطی

تراریختی بواسطه­ی آگروباکتریوم در غلات

در سال 1994 هیای و همکاران مدرک روشنی برای تراریختی پایدار برنج ژاپونیکا با آگروباکتریوم بعد از آنالیزهای ژنتیکی و مولکولی تعدادی از افراد نسل T1,T2,T0 تهیه کردند. این گزارش استفاده از آگروباکتریوم برای تراریختی ژنتیکی گیاهان غله سرسخت باز کرد. یک وکتور ثانویه در نژاد LBA4404 آگروباکتریوم به عنوان موثرترین نژاد برای تراریختی هر سه کولتیوار ژاپونیکا تشخیص داده شد. تراریختی بواسطه ی آگروباکتریوم برنج اکنون به عنوان یک روش با قابلیت تولید بالا و معتبر برای ژنهای انتقالی مورد نظر بدرون ژنوم برنج پدیدار شده است.

موفقیت هیای وهمکاران شور مضاعفی در تراریختی دیگر گونه های زراعی مهم مثل ذرت، گندم و جو بوجود آورد. با استفاده از راهکارهای هیای و همکاران، تراریختی ذرت با جداسازی جنین های نارس تازه آغاز شد. در ذرت فراوانی تراریختی با اضافه کردن نیترات نقره به محیط، تغییر در اجزای محیط و بهینه سازی شرایط هم کشتی و دوره ی زمانی ساکن بیشتر از برنج شد. همچینن در سال2002 برای اولین بار نشان داده شد که ذرت می تواند با استفاده از ترکیب وکتورهای دوگانه و سیستئین آنتی اکسیدانت در محیط هم کشتی تراریخت شود. به همین نسبت کارایی تراریختی بالایی بدست آمد. در همین سال، دیگر محققان به طور موفقیت آمیزی نشان دادند که ارقام ممتاز ذرت می توانند به صورت تقریبا کارایی با استفاده از آگروباکتریوم تراریخت شوند. این گزارش امکان توسعه ی نوترکیبی ذرت را بر روی کولتیوار A188 نشان داد.

موفقیت تراریختی بواسطه ی آگروباکتریوم در گندم و جو به سرعت بعد از ذرت دنبال شد. در مقایسه با برنج و ذرت، پیشرفت در گندم و جو کمتر صورت گرفته است. از زمان اولین گزارش تراریختی بواسطه ی آگروباکتریوم گندم در سال 1997، فاکتورهای متعددی که انتقال موثر T-DNA را سبب می شوند بررسی شده و تغییر یافته اند. استفاده از سورفاکتانت L-77 و تیمار خشک کردن در طی هم کشتی به طور معنی داری انتقال T-DNA را افزایش داد.

به دنبال موفقیت تینگای و همکاران در تراریختی بواسطه ی آگروباکتریوم جو  در سال 1997 ، تعدادی از آزمایشگاههای سرتاسر جهان تولید موفقیت آمیز گیاهان جو تراریخت را گزارش کردند. چون اکثر گزارشات موفقیت آمیز در تراریختی جو با ژنوتیپ های مدل "امید بخش طلایی"  و "ایگری" محدود می شود، تلاش های بیشتری برای توسعه ی تراریختی جو با سیستم آگروباکتریوم برای تولید کولتیوارهای ممتاز آن نیاز می باشد.

اگر چه گزارشات موفقیت آمیز در تراریختی بواسطه ی آگروباکتریوم در سورگوم گزارش شده اما حداقل دستکاری موفقیا آمیز برای کشت بافت و تراریختی آن با این سیستم مشخص شده است. بنابراین بهینه سازی پارامترهایی که برای تراریختی غلات مورد نظر هستند و غربال ریزنمونه های فوق العاده مستعد و ژنوتیپ ها بایدوسعت یافته و هدف تراریختی ژنتیکی با ژنهای مورد نظر قرار گیرند.

ادغام ژن، بیان آن و مشخصات گیاهان نوترکیب

توارث پایدار ژنهای خارجی در کاربرد غلات مهندسی ژنتیم شده برای کشاورزی دارای اهمیت هستند. فاکتورهای زیادی می توانند در تنوعات بیان ژن، تنوع در القای کشت بافت، تعداد کپی های ژن در گیاه نوترکیب، موتاسیون در گیاه تراریخت و خاموشی اپی ژنتیکی ژنها شرکت داشته باشد. خاموشی ژن می تواند در سطوح رونویسی و بعد از رونویسی اتفاق افتد و این پدیده اغلب با تعداد کپی های بالا در تراریخت همراه است. همچنین فعالیت شدید پروموتور با فوق متیلاسیون و القای رونویسی ژن  در گونه های دو لپه و تک لپه مرتبط است. بدون شک مشکل خاموشی تراریخت نگرانی های جدی را در مورد انتخاب لاین های تراریخت برای اصلاح غلات با صفات ویژه بر می آورد. به همین خاطر لاین های تراریخت که ژن های مهم اقتصادی را حمل می کنند نیاز به تست های دقیقی برای سطوح بیان ژن در هر نسل دارند.

الگوی ادغام، توارث و بیان ترانسژنها در گیاهان بعد از آلودگی با آگروباکتریوم و نوترکیبی مستقیم بوسیله ی حامل ها توسط محققان گزارش شده است. هر دو این روش ها معایب و مزایایی دارند که می تواند برای تولید گیاهان تراریخت با صفات مهم از لحاظ کشاورزی استفاده شوند هر چند هر دوی این روش ها منجر به ادغام  چندین کپی از ژن مورد نظر  در یک تک لوکوس  وبازآرایی ترانسژن ها با فراوانی بیشتر می شود. همچنین تراریختی بواسطه ی آگروباکتریوم منجر به حذف های بزرگ و کوچک ، دو برابر شدن یا بازآرایی توالی های DNA نزدیک گیاهی و یا این واکنش ها در ادغام DNA گیاهی ناپیوسته در حل ورود T-DNA می شود. مطالعه ی تراریختی غلات نشان می دهد که تراریختی بوسیله ی بمباران ریزپرتابه ها محدوده ی وسیعی از راهکارهای تراریختی با محدوده ی وسیعی از بیان ژن را آسان می کند که هیچ گونه محدودیت بیولوژیکی یا محدودیت میزبان را را تحمیل نمی کند و سلول های متنوعی می توانند برای انتقال DNA خارجی هدف قرار گیرند. با وجود این حقیقت که  سیستم انتقال ژن توسط آگروباکتریوم منجر به ادغام عناصر چندگانه در الگوهای متفاوت معکوس یا پشت سرهم تکراری می شود، تراریختی با آگروباکتریوم به عنوان یک روش انتخاب برای حصول گیاهان تراریخت با تعداد کپی های کمتر ، ژن های خارجی سالم و بیان پایدار ژن باقی خواهد ماند.

مشکلات موجود و چشم انداز آینده

در مقایسه با برنج، تراریختی با آگروباکتریوم در دیگر غلات اصلی تاخیر معنی داری در پشت سر دارد. قهوه ای شدن و نکروزه شدن بافت ها با دنبال آلودگی با آگروباکتریوم هنوز به عنوان یک مانع اصلی در تراریختی غلات مطرح است. بعد از آلودگی با آگروباکتریوم ، جنین های گندم و سلول های ریشه ممکن است پراکسید هیدروژن تولید کند. متعاقب آن مشاهده ی تغییر در ساختار دیواره ی سلولی دیده شده و در نهایت سطوح بالای نکروزه شدن سلولی و مرگ سلول به وقوع می پیوندد. همبستگی بین کاهش در مرگ سلولی و افزایش فراوانی تراریختی در غلات مشاهده شده است. تیمارهای ضد نکروزه کنده بافت های هدف ممکن است محیط مناسب برای برهمکنش آگروباکتریوم با سلول های گیاهی را بوسیله ی ممانعت از نکروزگی تامین کرده و منجر به افزایش کارآیی تراریختی شود.

 در تراریختی به واسطه­ی آگروباکتریوم غلات، کاهش نکروزه شدن و تعدادی از فاکتورها شامل ژنوتیپ، ریز نمونه، نژاد آگروباکتریوم، وکتور ثانویه، ژن مارکر قابل انتخاب و پروموتور آن، شرایط کشت همزمان، تلقیح و محیط هم کشتی، تیمار اسمزی، خشک کردن، غلظت آگروباکتریوم و سورفاکتانت، کشت بافت و محیط بازایی احتمالا در احیای سلول­های گیاهی پایدار بعد از آلودگی با آگروباکتریوم موثر است.

  از این فاکتورها تفاوت در مستعد بودن آگروباکتریوم برای آلودگی یک گونه خاص، ژنوتیپ یا گونه خاص هنوز به عنوان یک مانع نه تنها در توسعه­ی سیستم تراریختی بواسطه­ی آگروباکتریوم در کولتیوار­های برتر غلات مهم اقتصادی بلکه در کاربرد آگروباکتریوم به صورت متداول برای ورود ژنهای مورد نظر در غلات اصلی است.

  رابطه مستقیم نوع ریزنمونه، کیفیت و منبع آن با موفقیت در تراریختی ژنتیکی بواسطه­ی آگروباکتریوم گزارش شده است.برای مثال کار با جنین های نارس جدا شده­ی تازه با پیش تیمار و بدون پیش تیمار اکثریت گزارش­های موفقیت آمیز در تراریختی ژنتیکی غلات را در برداشته و بهترین نوع ریزنمونه ملاحظه می­شود. جنین های کالوس زای حاصله از بذور رسیده گزارش شده که به عنوان بهترین ریزنمونه برای تراریختی بواسطه­ی آگروباکتریوم در غلات  بواسطه تقسیم سلولی در آنهاست. تفاوت درآگروباکتریوم های مستعد برای آلودگی یک بافت خاص, ژنوتیپ یا گونه خاص به عنوان یک مانع مهم در تراریختی ژنتیکی  کولتیوارهای برتر غلات مطرح شده است. برای مثال یک سیستم تراریختی کارا در ذرت وسورگوم تنها با وکتورهای فوق ثانویه­ی LBA4404 شروع شد. درحالیکه یک وکتور ثانویه­ی استاندارد در یک نژاد فوق بیماریزا فراوانی تراریختی پایینی را حتی با  بهبود شرایط هم کشتی در ذرت نشان داد. اخیرا تعدادی از ژنهای گیاهی که به طور کاملا متفاوت در طی مراحل اولیه تراریختی بواسطه­­ی آگروباکتریوم بیان می­شد، تشخیص داده شده­اند. اکثر این ژنها بیان القا شده­ای در طی مراحل اولیه آلودگی با نژادهای متنوع آگروباکتریوم نشان داد. به طور جالبی آلودگی آگروباکتریوم تغییراتی در الگوی بیان ژنی القا یا بازدارندگی مجموعه­ای از ژنهای گیاهی خاص سلولهای میزبان را هدف قرار داده همچنین وینا و همکاران نشان دادند نقش T-DNA ویا پروتئین های ویروسی را به عنوان فاکتور­هایی که منجر به بیان متفاوت این ژنها در طی آلودگی آگروباکتریوم می­شد. لاینهایی از؟؟؟؟ که T-DNA وارد شده به آنها جهش  یافته برای سرسختی تراریختی بدنبال آلودگی باکتریایی  یک درجه بالایی از تنوع در میان اکوتیپ های تراریخت نشان داد. این مطالعه  پیشنهاد کرد که ژنهای گیاهی زیادی ممکن است در این فرایند درگیر باشد و بنابراین غربال چنین لاین­های موتانت شده ابزار مهمی برای فهم نقش ژنهای میزبان در طی برهمکنش با آگروباکتریوم خواهد بود. در همین راستا تشخیص فاکتورهای گیاهی شرکت کننده در تراریختی T-DNA  برای فهم بهتر و توضیح فرایندهای وقوع برای محدوده­­ی میزبانی و حساسیت سلول­های گیاهی به آلودگی آگروباکتریوم لازم است.

اخیرا چندین نمونه باکتریایی غیر آگروباکتریوم به طور موفقیت آمیزی برای تراریختی ژنتیکی در گونه­ی گیاهی مثل برنج استفاده شده است. تجزیه و تحلیل  نسل بروز تمام گونه­های سرگیاه ترانسفورم شده با sinorhizia meliloti توارث پایدار GUS تراریخت و فتوتیپ مقاومت به هیگرومایسین را نشان داد. این مطالعه پیشنهاد می­کند که تعدادی از باکتریهای متفاوت مرتبط با گیاه می­تواند به طور موفقیت آمیزی برای انتقال ژن  به گیاهان زراعی استفاده شود.

در انتها مطالعات عمیق و ارزیابی ژنهای مسئول برای تحریک تقسیم سلولی گیاه و برای تحریک مستعدی سلولهای گیاهی به آگروباکتریوم ممکن است ته تنها توسعه پروتکل های تراریخت ارقام ممتاز بلکه کارایی تراریختی در غلات را افزایش یابد. فهم مکانیزم­ها با تیمارهایی چون خشک کردن و تراریختی پایدار بدون شک توسعه سیستم­های تراریختی کارا را در غلات بهبود می­بخشد.

تراریختی با واسطه­ی آگروباکتریوم درگیاهان صنعتی مهم

انتخاب ریز نمونه یکی از موارد بسیار مهم در حصول نتایج موفقیت آمیز در تولید گیاهان ترارریخت است چون سلولهای درون این بافتها برای آلودگی با آگروباکتریوم مستعد باشند و همچنین قادر به باززایی گیاهان بارور و سالمی باشند. در بیشتر تحقیقا ت از ریزنمونه هیپوکوتیل و کوتیلدون حاصل از گیاهچه­های جوان به عنوان ریزنمونه برای تراریختی استفاده  شده است. به طور کلی در خانواده Braccicasea اغلب از ریزنمونه­ی هیپوکوتیل استفاده می­شود چون پاسخ دهی خوبی نسبت به شرایط باززایی از خود نشان میدهند. به هر حال استفاده از این ریز نمونه­ها مستلزم عبور سلولهای تراریخته از فاز کالوس­دهی با کشت­های سوسپانسیونی قبل از القای جنین های سوماتیکی برای احیا گیاهان تراریخت است. از این دو ریزنمونه به خوبی در تولید گیاهان تراریخت درکلزا و پنبه استفاده شده است اگرچه در پنبه گزارش­های اندکی در زمینه­ی ترارریختی سلولهای نوک ریشه پنبه وجود دارد اما تراریختی مستقیم سلولهای نوک ریشه دارای مزایای بدیهی مثل عدم نیاز به کشت بافت طولانی، کاهش زمان احیای گیاهان تراریخت و کاهش تنوع سوماکلونی است. علاوه بر این مزیت عمده دیگر این سیستم این است که باززایی از نوک ریشه مستقل از ژنوتیپ است اما به طور کلی حساسیت به ژنوتیپ در کشت بافت پنبه کم است. گاهی استفاده از ریزنمونه­ی هیپوکوتیل سبب ایجاد مشکلاتی می­شود. درکلزا از ریزنمونه­ی هیپوکوتیل استفاده می­شود. قطعات ریزنمونه هیپوکوتیل فوق­العاده حساس بوده و مستعد برای نکروزه شدن هستند. در آفتابگردان که گیاهی هم سرسخت به شرایط باززایی و هم تراریختی به آگروباکتریوم است از ریزنمونه­ی هیپوکوتیل و کوتیلدون به عنوان ریزنمونه استفاده نمی­شود زیرا تراریختی متداول این محصول نیازمند کشت سلولهای مستعد برای باززایی و هم ترارریختی است به این دلیل بهترین نتایج برای تراریختی با آگروباکتریوم در این گیاه با دونیم کردن محور جنینی بالغ در ژنوتیپ Ha89 بدست آورد.

برای گیاهانی که به شرایط تراریختی سخت بازده هستند میتوان از تیمارهای متفاوتی استفاده کرد.کارایی تراریختی کلزا را بوسیله­ی سازگاری ریز نمونه در محیط کار کشت القای کالوس قبل از مرحله­ی هم­کشتی میتوان افزایش داد. وقتی بافت گیاهی زخمی می­شود ترکیباتی که بیماریزایی را القا می کنند از این سلولهای آسیب دیده به درون محیط اطرافشان مترشح می­شود در این حالت بافتهای زخمی دریک وضعیت فعال از لحاظ مواد متابولیکی قرار می­گیرند. سلولهایی که از این سلول های زخمی بوجود می­آیند از لحاظ تقسیم سلولی فعال بوده و تمایل بیشتری برای ترارریختی از خود نشان میدهند.به همین خاطر تیمار آسیب فیزیکی مثل ایجاد زخم با تیغ.شیشه و...می­تواند سبب تحریک و افزایش تراریختی با آگروباکتریوم شود. با شناسایی مواد فنولی که القا کننده­ی ژنهای بیماریزای آگروباکتریوم هستند امروزه از ماده­ای بنام استوسرینگون به عنوان عامل افزایش دهنده­ی فراوانی تراریختی در بسیاری از گونه­ها از جمله کلزا و آفتابگردان استفاده می­شود.

از عوامل مهم دیگر در فراوانی ترارریختی میزان غلظت باکتری است که بر حسب OD تعیین می­شود. میزانOD  برای گیاهان صنعتی مهم متفاوت است. OD>1  کارایی تراریختی کلزا را کاهش می­دهد و بهترین فراوانی تراریختی در OD=0.6-1 بدست آورد حال آنکه این میزان برای پنبه OD=1.6-1.9 و برای خردل هندی OD=.6 بود.

زمان تلقیح نیز بسته به گیاه  و گونه­های آنها متفاوت است. زمان تلقیح 30 دقیقه برای کلزا، یک ساعت برای خردل هندی و 72 ساعت برای آفتابگردان بدست آمده است.

معمولا برای برخی از زیر نمونه ها در برخی از گیاهان نیاز به تیمارهایی قبل از کشت است. اما گاهی تنها قرار دادن ریز نمونه در شرایط محیط کشت سبب کم شدن اثر تنش حاصل از قطع ریز نمونه شده و پس از تلقیح با آگروباکتریوم که خود نیز به عنوان یک شوک عمل می­کند فراوانی تراریختی افزایش میابد. تراریختی با فراوانی بالا در کلزا می­تواند بوسیله بهینه سازی زمان سازگاری ریزنمونه قبل از تلقیح و همچنین زمان هم­کشتی با آگروباکتری بدست می­آید. درگیاه کلزا زمان سازگاری به محیط کشت 72 ساعت و زمان هم کشتی 48 ساعت به طور فزاینده­ای کارایی ترارریختی را تا 25% افزایش می­دهد. این سازگاری قبل از تلقیح با محیط کشت کالوس­دهی، کارایی تراریختی را بویژه در گیاهان سخت پاسخ ده افزایش می­دهد.

شرایط نوری نیز میتواند در تراریختی تاثیر گذارد. این میزان از 16 ساعت روشنایی در کلزا، پنبه و آفتابگردان تا نور ممتد برای خردل وحشی متفاوت است.

اگر قرار است تراریختی با آگروباکتریوم با فراوانی بالا و به صورت کارایی صورت پذیرد گاهی عوامل مفید قربانی میشوند، که در نتیجه آن مشکلات دیگری بروز می­یابد. در کلزا برای حصول بازایی زیاد باید واکشت­های بیشتری انجام داد و احتمال افزایش تنوع سوماکلونی به علت افزایش طول زمان مدت کشت افزایش می­یابد. همچنین بدلیل مزایای ریز نمونه­ی هیپوکوتیل در تراریختی کلزا از این نمونه برای تلقیح با آگروباکتریوم استفاده می­شود که در نتیجه نکروزه شدن صورت می­گیرد که برای حل این مشکل و غلبه بر نکروزه­شدن سازگاری ریز نمونه لازم و بهینه سازی زمان هم کشتی با آگروباکتریوم نیاز است.کادوزا و همکاران کارایی تراریختی در کلزا را با بهینه سازی زمان سازگاری ریز نمونه ها و زمان هم کشتی با آگروباکتریوم افزایش داده­اند.

در گیاه کلزا احیای گیاهان تراریخت با  غلبه بر غرق شدن و افزایش کارایی ریشه­دهی گیاهان بهبود و کارایی ریشه دهی با دستکاری محیط کشت تا 100%  افزایش یافت. برای غلبه بر غرق شدگی از افزایش 2 به 3 گرم در لیتری ژلرایت در محیط ریشه­دهی و طویل­شدن ساقه استفاده شد. با افزایش غلظت ژلرایت آب در دسترس ساقه کاهش یافته در نتیجه غرق شدگی ریز نمونه هم کاهش یافت. در گیاه کلزا ریشه­دهی در محلول 1/2MS بسیار کاراتر از محلول MS  کامل عمل می­کند و کاهش غلظت ساکارز از 30 به 10 گرم در لیتر در محیط ریشه زایی بسیار کاراست. این محیط کشت باعث 100% ریشه­دهی می­شود در حالیکه در محیط MS کامل و 30 گرم در لیتر شکر در عوض تولید ریشه طویل شدن ساقه ها رخ می­دهد.

در تراریختی خردل هندی اضافه کردن یاورهایی مثل نیترات نقره برای محیط کشت انتخابی برای حصول کارایی بالای تراریختی لازم است. نیترات نقره به عنوان ممانعت کننده اتیلن عمل کرده و باعث افزایش فراوانی بازایی مناسب گیاهان تراریخت می­شود. (بویژه در گیاهان خانواده کلزا) بویژه هنگامی که کانامایسین به عنوان نشانگر قابل انتخاب استفاده می­شود. در این گیاه همچنین واکشت هر هفته­ای برای حصول حداکثر گیاهان تراریخت نیاز است. در خردل هندی شیشه­ای شدن ساقه­های باززا شده گاه گاهی در کشت بافت مشاهده می­شود که میتوان با کاهش همزمان سطوح سیتو کینین و نیترات نقره و افزایش میزان آگار از آن ممانعت کرد.

در آفتابگردان استفاده از تیمار ریز نمونه جنین با آنزیم MACERATING  که نوعی پکتیناز است برای افزایش سطوح ELICITORهای گیاهی یا استفاده از آنزیمهای دیگری که تخریب کننده دیواره سلولی هستند سبب افزایش فعالیت ژن های VIR آگروباکتریوم می­شود. در این گیاه استفاده از هر سیستم به عنوان ریزنمونه در یک پروتوکل تراریختی نشان می­دهد که ساقه ها و گیاهان شیمر بدست می­آید. درصد بافتهای شیمریک بستگی به وسعت محیطی دارد که بوسیله آگروباکتریوم در هنگام آلودگی  پوشیده خواهد شد. همچنین تلاش­هایی برای افزایش پتانسیل باززایی در منطقه هر سیستمی با بمباران با ژن IPT  که ایزوپنتیل ترانسفراز را کد میکند صورت گرفته است. این آنزیم در بیو سنتز سیتوکینین در گیاهچه­ها درگیر است. با بیان موقت این ژن، افزایشی در تعداد ساقه­ در ازای هر ریز نمونه مشاهده شد که در این حالت میزان تراریختی از حداکثر 5.2% به 6% افزایش یافت.

تراریختی با واسطه­ی آگروباکتریوم در حبوبات

تراریختی با آگروباکتریوم در گیاهان خانواده حبوبات نیز همانند سایر خانواده­های گیاهی به وفور و مستقیما وابسته به پاسخ کشت بافت است. به همین خاطر برای تراریختی نیاز به کشت­های با قابلیت باززایی بالا و نیز به سلول­های مستعد برای دریافت ژن­های خارجی دارد.

در تراریختی این گیاهان معمولا از کشت­های مستقیم، جنین­زایی سوماتیکی و استفاده از اندام­های رویشی و بافتی صورت می­گیرد. استفاده از چندین نوع کشت بافت پایه در مراحل مختلف رشدی و برای تحریک فرآیندهای مختلف نموی بویژه برای لگوم­های علوفه­ای متداول است. برخلاف گیاهان صنعتی که عمدتا تراریختی از دو ریزنمونه­ی هیپوکوتیل وکوتیلدون صورت می­گرفت در این خانواده از منابع مختلف ریزنمونه­ای برای تولید گیاهان تراریخت استفاده می­شود.

نخودگیاهی سرسخت به کشت بافت است و باززایی موثر آن تنها ممکن است با استفاده از ریزنمونه­های بر پایه­ی گره­های کوتیلدونی و یا ریزنمونه­های حاصل از انتهای ساقه­های گیااهچه­های جوان استفاده شود. روش موثر تراریختی نخود با حصول حداکثر گیاهان تراریخته هنگامی بدست آمد که از ریزنمونه­ی مریستم انتهایی با حذف جوانه­ی انتهایی و غلبه بر خواب جوانه­های ساقه بدست آمد. در نخودفرنگی پس از جمع آوری بذور نارس از مزرعه، کوتیلدون­های نارس انها به عنوان ریزنمونه برای تراریختی استفاده شد.

استراتژی­هایی که برای باززایی لگوم­های علوفه­ای استفاده می­شود شامل اندام­زایی و جنین­زایی با استفاده از منابع مختلف ریزنمونه­های بافتی مثل استولون، جنین­های نارس، کشت سلول­های سوسپانسیون و پروتوپلاست است. به طور کل ارقام ممتاز لگوم­های علوفه­ای بالای باززایی را از خود نشان نمی­دهند. در شبدر از ریزنمونه­ی کوتیلدون برای تراریختی مستقل از ژنوتیپ، نیرومند و با قابلیت تکثیر بالا برای گونه­های مختلف آن استفاده شد. در حالیکه در یونجه از ریزنمونه برگی از ژنوتیپ­هایی که قابلیت باززایی بالایی داشتند به عنوان ریزنمونه استفاده شد. در این گیاه عمدتا از واریته­ی regen-SY که سرعت باززایی سریع و بالایی دارد استفاده می­گردد. در سویا هدف گیری انتقال T-DNA به درون سلول­های با قابلیت باززایی بالا بویژه بافت­های مریستمی گره­ی کوتیلدونی هدف بوده است. که به دنبال آن انتخاب برای تکثیر سلول تراریخته و شکل­گیری ساقه صورت می­گیرد. باززایی از طریق جنین­های سوماتیکی به عنوان یکی از روش­های کارا در مطالعه­ی تراریختی در گیاهان عنوان شده است. یک سیستم باززایی مستقیم به خاطر سرعت مورفوژنسیس بالا و عدم نیاز برای واکشت­های متوالی دارای مزایای زیادی است. در این حالت تولید پریموردیای ساقه فوق­العاده سریع و همزمان با آغاز تمایز سلولی است. چنین سیستم باززایی، سیستمی مطلوب برای دسترسی آسان آگروباکتریوم به سلول­های مریستمی است و عمدتا همین سلول­های سطحی هستند که در طی هم­کشتی برای تراریختی در معرض آگروباکتریوم قرار می­گیرند. این سیستم در تولید گیاهان تراریخت در گیاه بادام زمینی به خوبی به کار گرفته شده است. حال آنکه در تراریختی سویا با ریزنمونه­های کوتیلدونی نارس با القای مستقیم جنین­های سوماتیکی تراریخته از ریزنمونه­های کشت شده بر روی محیط انتخابی بعد از هم­کشتی بدست آمد که در مرحله­ی بعدی بوسیله­ی بلوغ و باززایی جنین­های سوماتیکی منفرد به گیاه کامل دنبال شد. اگرچه این روش به عنوان روشی ساده ، سریع وبا قابلیت تولید و کاربردی برای طیفی از ارقام با بذور در گروه­های با رسیدگی مختلف تهیه شده است اما کارایی تراریختی آن 1.7% است و نیاز به بهینه سازی بیشتری برای تولید یک سیستم با کارایی بالا دارد. بهینه سازی شرایطی مثل بهبود شرایط هم­کشتی، کشت بافت و انتخاب گیاهان تراریخته

عموما در تراریختی گیاهان با آگروباکتریوم از محیط کشت کالوس دهی بر پایه­ی یکی از محیط­های کشت پایه مثل MS, B5 و... استفاده می­شود. در خانواده حبوبات نه تنها استفاده از محیطهای کشت مختلف در تراریختی گیاهان متفاوت رایج است بلکه گاهی در تراریختی یک گیاه نیز در مراحل مختلف رشدی از محیط­های کشت پایه­ی متفاوت و گاهی استفاده استفاده از یک محیط کشت پایه با تغییر در غلظت برخی نمک­ها توسط نمک­های کشت­های پایه­ی دیگر مشاهده می­شود. در یونجه از مادده­ی جامد کننده­ی Bactoagar در محیط کشت پایه­ی B5 برای محیط کشت انتخابی (برای حذف آگروباکتریوم و سلول­های گیاهی غیر تراریخت )، محیط هم­کشتی، محیط تحریک و آغاز کالوس دهی، القا و توسعه­ی جنین­های سوماتیکی تراریخته استفاده می­شود. در همین گیاه از ماده­ی  جامد کننده­ی phytablend بر پایه­ی محیط کشت MS برای نگهداری گیاهان غیرتراریخت (حاوی آنتی بیوتیک) در شرایط in vitro با جایگزینی غلظت ویتامین­های آن با محیط Nitsch-Nitsch، محیط رشد گیاه (فاقد عامل انتخابی برای سلول­های نوترکیب) و ریشه­دهی به کار می­رود. در سویا نیز از محیط کشت MS برای ساقه­دهی و محیط کشت B5 برای ریشه­دهی و همچنین برای جوانه زنی و هم­کشتی با آگروباکتریوم استفاده می­شود.

در این خانواده از لحاظ طول زمان هم­کشتی نیز تفاوت­هایی دیده می­شود. زمان هم­کشتی از 7-8 روز برای یونجه تا 48 ساعت برای نخود متغیر بوده است.اما برخلاف زمان هم­کشتی که در گیاهان مختلف این خانواده مختلف است، میزان ODهای تقریبا مشابهی برای حصول حداکثر تراریختی نیاز بوده است( OD=0.6-0.8). زمان مایه کوبی با آگروباکتریوم نییز از 1-2 ثانیه برای نخود تا 45 دقیقه همراه با عمل shaking برای شبدر متفاوت است.

در تراریختی با آگروباکتریوم در گیاهان مختلف عمدتا از نژادهای مختلف آگروباکتریوم مثل AGL1, LBA4404 با ژن انتخابگر مقاومت به کانامایسین، KYRT1 با ژن اتنخابگر فسفینوتریسین و EHA101 با ژن انتخابگر هیگرومایسین استفاده می­شود. اگرچه نوع نژاد آگروباکتریوم از اهمیت زیادی برخوردار است اما گاهی مهمتر از نوع ریزنمونه، نوع نژاد آگروباکتریوم است مثال بارز آن در گیاه نخود فرنگی و یونجه است. در یونجه نژاد LBA4404 بیشترین کارایی را دارد و نژادهای دیگر ممکن است باعث قهوه­ای شدن و کاهش کارایی تراریختی شوند.

به طور کلی در حبوبات حساسیت به نژاد آگروباکتریوم نسبت به خانواده­های دیگر کمتر است و عمدتا از نژادهای LBA4404(در سویا یونجه نخود)، EHA101(نخودفرنگی، سویا)، AGL1(نخودفرنگی، سویا)، C58 و KYRT1 استفاده می­شود.

حذف آگروباکتریوم از محیط کشت عموما با یکی از آنتی بیوتیک­های سفوتاکسیم، کاربنسیلین، تیکارسیلین و تیمنتین صورت می­گیرد. غلظت و کیفیت این آنتی بیوتیک­ها نقش بسیار مهمی در موفقیت تراریختی دارد. در صورتی که غلظت آنتی بیوتیک کم باشد یا طول دوره­ی هم کشتی یا تلقیح با آگروباکتریوم زیاد باشد در این حالت آلودگی­ها ناخواسته بویزه در مراحلی که آنتی بیوتیک از محیط انتخابی حذف می­شود، صورت می­گیرد و این امر باعث نیاز به واکشت­های متوالی را افزایش می­دهد. عموما قبل از انتقال باکتری از محیط هم کشتی به محیط انتخابی، ریزنمونه­ها با آب دوبار استریل شسته شده و سپس به محیط انتخابی منتقل می­شوند.