مکانیسم­ های مولکولی مقاومت به ویروس­ های گیاهی (مقاله تخصصی)

ویروس­های گیاهی ویروس­هایی هستند که گیاهان را آلوده می­کنند. مشابه تمام ویروس­ها، ویروس­های گیاهی پارازیت­های اجباری درون سلولی هستند که مکانیسم مولکولی مورد نیاز برای همانند سازی را بدون میزبان ندارند. کشف ویروس­های بیماریزای گیاهی به سال 1898 توسط شخصی به نام مارتینوس بر می­گردد. وی با فیلتر کردن برگ­هایی که علایم موزاییک توتون را نشان می­دادند متوجه شد که عوامل دیگری بجز باکتری­ها که از فیلتر عبور نمی­کنند، از فیلتر عبور کرده و می­تواند سبب ایجاد بیماری در گیاهان سالم شود. بعد از کشف­های اولیه در مورد مفهوم ویروس و بعد از اختراع میکروسکوپ الکترونی و با ااستفاده از آن تعداد بیشتری از ویروس­ها شناسایی و در سال 1939 اولین لیست طبقه­بندی شده از 129 ویروس گیاهی منتشر شد. 

 

امروزه بیشتر تحقیقات بر روی فهم ژنتیکی و بیولوژی مولکولی ژنوم ویروس­های گیاهی متمرکز شده است. هدف از این تحقیقات فهم چگونگی همانندسازی ویروس، انتقال آنها و آلودگی در گیاهان است. فهم ژنتیک ویروس­ها و نقش پروتئین­های آن­ها برای بررسی بنیه­ی آن­ها برای استفاده­ی تجاری در شرکت­های بیوتکنولوژی بوده است. بویژه، توالی­های حاصله از ویروس برای درک بهتر اشکال جدید مقاومت استفاده شده است. همین پیشرفت­های خیره کننده­ی سال­های اخیر به محققین این اجازه را داده است تا ویروس­های گیاهی را برای راهکارهای جدید برای تولید پروتئین­های جدید با ارزش به خدمت بگیرد.

مدیریت ویروس­های گیاهی:

راهکارهای متداول برای برای مدیریت بیماری­های ویروسی به طور معمول به صورت زیر تعریف می­شود.

الف) مبارزه­ی شیمیایی که بدلیل هزینه­ی بالا و اثرات سوء زیست محیطی اگرچه جزو یکی از معمولترین روش­های مبارزه است اما زیاد کارا به نظر نمی­رسد.

ب) مدیریت کلاسیک بیماری­های ویروسی با کنترل جمعیت ناقل با استفاده از حشره کش­ها، استفاده از مواد گیاهی عاری از ویروس، استفاده از کولتیوارهای مقاوم، غربال موتانت­ها، تلاقی­های برگشتی برای انتقال ژن­های مقاومت از گیاهان مقاوم به حساس، روش­های کشت اختصاصی و ... صورت می­گیرد. برای مثال از روش تلاقی برگشتی برای هرمی کردن ژن­های مقاومت به ویروس موزایک سویا حاصل شده است.

ج) تولید ارقام مقاوم که کم­هزینه­ترین و نیز سالم­ترین روش مبارزه برای ویروس­های گیاهی است. برای مثال در گیاه زینتی گل ساعتی و گیاه زراعی جو انتقال ژن­های مقاومت سبب کاهش و یا حذف علایم ویروس موزایک لوبیا و ویروس ... به ترتیب  از روی گیاهان گل ساعتی و جو شده است.

مقاومت مولکولی به ویروس­ها:

به دلیل اندازه نسبتاً کوچک ژنوم­ ویروس­های گیاهی توسعه راهکارهای مولکولی برای کنترل بیماری­های ویروسی گیاهی به طور خاص موفق بوده است. راهکارهای متفاوتی برای استفاده از فناوری مولکولی به منظور تلفیق با ایجاد فاکتورهای مقاومتی جدید در سیستم­های ویروسی گیاهان وجود دارد. روال کار به این نحو است که آن دسته از محصولات ژن یا ژن­های ویروسی شناسایی شوند که وقتی در زمان نامناسب یا به مقدار نادرست وجود دارند، با کارکردهای نرمال فرآیند آلودگی دخالت نموده و مانع از پیشرفت بیماری می­شوند.

چند نکته قابل تامل در مورد مقاومت:

• گیاه مقاوم گیاهی است که آلودگی را نشان نمی­دهد یا آلودگی با نسبت کمتر یا علایم بیماری با سرعت کمتریی نسبت به گیاهان حساس مشاهده می­شود.
• آزمایشات مقاومت بر این پایه استوار است که چگونه یک گیاه می­تواند پروسه­ی بیماری را متوقف یا کند سازد.
• مقاومت به ویروس شامل تداخل در هر مرحله­ای از سیکل آلودگی ویروس مثل وارد شدن به درون میزبان، همانندسازی، حرکت در بین یا در درون سلول­ها و انتقال از محل اولیه­ی آلودگی به بخش­های دیگر گیاه می­باشد.
• اکثر ویروس­های گیاهی ژنوم RNA تک رشته­ای مثبت sense دارند اگرچه بعضی از ویروس­های مهم نیز ژنوم DNA منفی یا مثبت و تک رشته­ای یا دو رشته­ای دارند.

جایگاه نشانگرهای مولکولی:

استفاده از نشانگرهای مولکولی در جهت شناسایی ژن­های مقاومت و استفاده از آن­ها برای انتخاب گیاهان مقاوم در شرایط درون شیشه است. برای شناسایی نشانگرهای پیوسته با ژن مقاومت مراحل زیر به ترتیب انجام می­شود. ابتدا باید جمعیت در حال تفرق با زمینه­ی ژنتیکی یکسان تهیه شود سپس تلقیح عامل بیماریزا به این جمعیت صورت می­گیرد. بعد از آن کلیه­ی افراد جامعه نسبت به مقاومت یا حساسیت به عامل بیماریزا به دو گروه مقاوم و حساس طبقه بندی می­شوند. سپس مقایسه­ی توده­ها با والدین حساس و مقاوم صورت گرفته و نشانگرهایی که معرف حساسیت یا مقاومت هستند را می­توان بدست آورد. در انتها تجزیه پیوستگی روی باندها انجام و در صورتی که مکان ژنی نشانگر نزدیک به ژن مقاومت یا حساسیت باشد می­توان از وجود نشانگر به مقاومت پی برد.

نشانگرهای مولکولی ابزاری ارزشمند برای شناسایی تعداد ژن­های مقاومت، مطالعه­­ی رفتار این ژن­ها و شناسایی محل قرارگیری این ژنهاست. همچنین با استفاده از نشانگرهای مولکولی، نیاز  به آزمایش تعداد زیاد بوته در شرایط گلخانه و یا مزرعه تحت شرایط آلودگی کاهش می­یابد. امکان شناسایی مقاومت در مراحل اولیه رشد وجود دارد و زمان تولید واریته­های جدید به طور قابل ملاحظه­ای کاهش می­یابد.

مکانیسم­های طبیعی گیاهان برای مقاومت به ویروس­ها:

مهمترین عامل ساختمانی در ممانعت از ورود ویروس­های گیاهی، ساختار دیواره­های سلولی گیاهی است. دیواره­ی سلولی به عنوان ساختار حیاتی محکم به عنوان یک سد طبیعی مانع از ورود اولیه ویروس بدرون گیاه می­شود.

 مکانیسم دفاع فعال با واکنش فوق حساسیت یکی از مهمترین و موثرترین مکانیزم­های دفاع فیزیولوژیکی است. مرگ سلول­های اطراف آلودگی بر طبق مرگ برنامه­ریزی شده­ی سلول که با ظهور علایم نکروتیک مشخص می­شود مانع از انتقال ویروس­ها به سایر بخش­های گیاه می­شود. ایجاد این واکنش بوسیله­ی شناسایی اختصاصی ویروس توسط ژنهای غالب مقاومت (R ) به ژنهای ویروسی صورت می­گیرد.

مخافظت از آلودگی ویروسی می­تواند بوسیله­ی ژن­های مقاومت موجود در ژرم پلاسم ها بدست آید. این ژن­ها می­توانند به صورت غالب R و هم به صورت مغلوب باشند. مثالی از ژن­های R، ژن مقاومت به ویروس Y سیب زمینی، Rx2 و Rx1 برای ویروس X سیب زمینی(PVX)، SW5 برای مقاومت به ویروس پژمردگی لکه­ای گوجه فرنگی(TSWV) است. برخی از این ژن­های مقاومت R برای ایجاد مقاومت به گیاهان تراریخت منتقل شده­اند. به جز ژن­های R، ژن­های مغلوب طبیعی نیز گزارش شده­اند. مشخص شده است که چندین ژن گیاهی مثل فاکتور شروع یوکاریوتی 4E (eIF4Eiso) برای تکمیل چرخه­ی آلودگی ویروس در سلول­های گیاهی نیاز به این فاکتور دارند و گیاهان جهش یافته­ای که فافد ژن عملکردی eIF4Eiso هستند نسبت به پوتی­ویروس­ها مقاوم­اند.

مقاومت منتج شده از پروتئین­های ساختمانی

مقاومت منتج شده از پروتئین پوششی همسان :

 این نوع مقاومت اشاره به مقاومتی دارد که در آن پوشش پروتئینی یک ویروس سبب مقاومت به آلودگی در برابر همان ویروس می شود. این نوع مقاومت برای اولین بار توسط آبل در سال 1986 با بیان ژن پروتئین پوششی ویروس موزاییک تنباکو در گیاه تنباکو نشان داده شد. گیاهان تراریخت حاصله یا علایم آلودگی به ویروس را نشان ندادند یا آنهایی که این علایم را نشان دادند با تأخیر نسبت به نمونه­های شاهد علایم آلودگی را ظاهر کردند.

نظریه متفاوتی برای توضیح مکانیسم مقاومت به واسطه پروتئین های پوششی پیشنهاد شده است. مهمترین و مقبول ترین مدل ارائه شده پیشنهاد می­کند که گیاهان تراریخته با ژن پروتئین پوششی باعث ممانعت از جزء جزء شدن ویروس­های کامل برای در معرض قرار گرفتن مواد ژنتیکی برای رونویسی می شوند. جزءجزء شدن ویروس یکی از مراحل اولیه آلودگی ویروسی است. که در طی آن انتهای RNA ^/5 ویروسی در معرض ریبوزوم قرار گرفته و از رویORF آن پروتئین پوششی ترجمه می­شود( البته پروتئین پوششی یکی از پروتئین­هایی است که ترجمه می­شود). عمل ترجمه چند دقیقه بعد از آلودگی سلول­های توتون با ویروس موزائیک توتون (TMV) در پروتوپلاست رخ می­دهد. سلول­های آلوده حاوی استریپوزوم، ویرویون های بدون پوشش جزءجزء شده، ریبوزوم­ها و ملکول­های پلی پپتیدی در حال تشکیل هستند. به هر حال در پروتوپلاست سلول­های گیاهی تراریخت با ژن پروتئین پوششی TMV از جزء جزء شدن ویریون­ها ممانعت به عمل آمده بود. حذف کامل و جزیی پروتئین­های پوششی بوسیله تیمار با آلکالین توانست اثر محافظتی مقاومت بواسطه­ی پروتیئن­های پوششی را از بین ببرد این نتایج پیشنهاد کرد وقتی ویروس مهاجم انتهای RNA ^/5 کد کننده زیر واحد پروتئین پوششی خود را آزاد می­کند، پروتئین­های پوششی نو ترکیب بلافاصله اجزاء ویروسی را دوباره پوشش­دار می­کنند و بدین طریق از آلودگی­شان ممانعت به عمل می­آید. از این نتایج بر می­آید که  CO-translational disassembly در مراحل اولیه آلودگی ویروس مرحله­ای کلیدی برای تعیین این مسئله است که آیا ویروس می تواند به مقاومت با واسطه پروتئین پوششی غلبه کند یا خیر؟

جزءجزء شدن ویروس موزائیک تنباکو به واسطه اثرات متقابل واکنش­های تدافعی بین گروه های کربوکسیل - کربوکسیل زیر واحدهای آمینواسیدی مستقر شده در حد فاصل زیر واحدهای پروتئین پوششی استوار است. تغییرات در، ph غلظت یون کلسیم در محیط سلولی می تواند واکنش این گروه­های باردار منفی را تسهیل کند و در نتیجه آن ویریون­های بی ثبات شروع به جزءجزء شدن می­کنند. به همین خاطر در گیاهان تراریخته با ژن پروتئین پوششی TMV فرض می شود که محیط عمومی متداول، مناسب جهت سرهم کردن ویریون­هاست تا جزءجزء کردن آنها .

این توانایی خود سرهم شدن پروتئین پوششی که برای مقاومت بواسطه پروتئین پوششی در TMV ضروری است برای همه ویروس­های گیاهی ضروری نمی­باشد. برای مثال بیان تراریخت یک موتانت درTMV  که فاقد ویژگی سرهم شدن قطعات ویروسی به صورت خود به خودی بود، هیچ گونه مقاومتی علیهTMV  در توتون ایجاد نکرد. شایان ذکر است که در برخی موارد حتی بیان پروتئین پوششی ویروس، آلودگی را افزایش داده است. برای مثال این مسئله در مورد ویروسRYMV  در برنج گزارش شده است.

مقاومت به واسطه پروتئین های پوششی ناهمسان :

اندرسون و همکاران در سال 1998 گزارش کردند که تنباکوهای تراریخت که پروتئین پوششی TMV را در سلول های خود جمع می کردند در آلودگی به ویروس­های ناهمسان مثلPVX  تاخیر نشان می­دهند. این پدیده مقاومت به واسطه پروتئین­های پوششی ناهمسان را نشان می­دهد. این نوع مقاومت اغلب سطوح پائینی از مقاومت را نشان می­دهد. دیده شده است که این مقاومت به وسیله تداخل کوتاه با گسترش سیستمیک و پیشرفت بیماری هنگامی که مقاومت حاصله از پروتئین پوششی همسان کاهش یافت یا آلودگی سیستمیک نبود، بروز یافت .

سه مدل ممکن برای مقاومت بواسطه پروتئین پوششی ناهمسان پیشنهاد شده است:

الف)پروتئین پوششی نوترکیب  اثر متقابل دارد و در دسترس بودن جدایه­های RNA های ویروسی ناهمسان  برای رپلیکاز محدود می­شود. این مدل نمونه­ای برای پوشش پروتئینی TMV است که می تواند RNA های ویروسی ناهمسان را پوشش­دار کند.

ب)پروتئین پوششی نوترکیب با یکی یا تعدادی از گیرنده­های اصلی مورد نیاز برای آلودگی ویروس و همانندسازی آن تداخل ایجاد می­کند. باید توجه داشت که مقاومت به واسطه پروتئین پوششی ناهمسان بخاطر اختصاصی­بودن گیرنده­ها به همان موثری مقاومت به واسطه پروتئین های پوششی همسان نیست.

ج)مقاومت شاید در نتیجه راه اندازی پاسخ های دفاعی درونی میزبان بوسیله پروتئین پوششی نوترکیب باشد.

در زیر نمونه ­هایی از مقاومت­های ایجاد شده بوسیل ه­ی پروتئن­های پوششی آورده شده است.

 مقاومت به واسطه پپتید :

 به نظر می­رسد کاربرد عمومی مقاومت بواسطه پپتید زیاد گسترده نباشد زیرا نیاز به سطوح بالایی از پروتئین­های نوترکیب می باشد. سطوح بالایی از mRNA نوترکیب لازم است تا بتواند خاموشی ژن بعد از رونویسی راه­اندازی شود. به همین خاطر بهبود این راهکار وابسته به بهبود کارایی رونویسی mRNA نوترکیب و ثبات سطح بیان پروتئین است.

اخیرأ رادولف و کالوگوس مقاومت به واسطه پپتید را برای طیف وسیعی از گیاهان در برابر توپسو ویروس­ها ایجاد کرده­اند. غربال آزمایشگاهی بیان پپتید بوسیله سیستم هیبرید دوگانه مخمر آزمایش شد. ابتدا آنها پپتیدهایی را شناسایی کردند که می­توانست با میل ترکیبی به دومین عملکردی نوکلئوپروتئین ویروس TSW متصل شود. همچنین چندین پپتید تشخیص داده شد که می­توانستند به نوکلئوپروتئین ویروس­های نزدیک به خانواده توپسوویروسها متصل شوند. نو ترکیب­کردن با این پپتید سبب ایجاد مقاومت گیاهان نوترکیب به TSWV،‌ GRSV  و CSNV شد. چون مکانیسم مقاومت به واسطه پپتید وابسته به دخالت غالب منفی نقش­های پروتئین­های ویروسی ضروری است جای تعجب نیست که این فناوری بتواند برای ویروس­های DNA نیز به همین خوبی توسعه یابد. در همین راستا لوپز و اُچا نشان دادند که بیان یک پپتید، رپلیکازTGMV  را هدف می­گیرد که این مسئله می تواند باعث مقاومت به این جمنی ویروس شود.

مقاومت بواسطه ­ی پروتئین­های غیر ساختمانی Non-structural protein mediated resistance

ویروس­ها، پروتئین­های غیر ساختمانی کد می­کنند که برای همانندسازی ضروری می­باشند. اخیرا تعدادی از این پروتئین­های غیر ساختمانی Replicase کشف شده است که وقتی در گیاهان تراریخت بیان می­شوند، درجات بالایی از مقاومت به آلودگی ویروسی را ایجاد می­نمایند. گلمبوسکی و همکاران در سال 1990 برای اولین بار این پدیده را با بیان چهارچوب قرائت باز 54 کیلو دالتونی ویروس TMV در توتون تراریخت نشان دادند. توتون تراریخت مقاوم به قهوه­ای شدن زودرس PEBV و سیب زمینی مقاوم به ویروس X (PVX) تولید شد.

مقاومت به واسطه RNA

خاموشی ژن بعد از رونویسی PTGS

خاموشی ژن بعد از رو نویسی یک مکانیسم محافظت شده برای تنظیم mRNA در گیاهان، حیوانات و قارچ­هاست. این مکانیسم به وسیله تجزیه ذاتی یا تراریخت mRNAها در سیتوپلاسم مشخص می­شود که در نتیجه آن بیان ژن کاهش می­یابد. در گیاهان این نوع خاموشی ژن فرآیندهای نموی متعددی را کنترل می­کند و تجمع آن تنظیم کننده­ی ایمنی ذاتی به ویروس­هاست. دو نشانه برای خاموشی ژن بعد از رونویسی وجود دارد . اول اینکه خاموشی mRNAهای هدف در سیتوپلام رخ می­دهد و دوم مولکول­های کوچک RNA (21-25 نوکلئوتیدی) از mRNAهای هدف خاموش شده به وجود می­آید. دو نوع RNA کوچک با توجه به تفاوت­هایشان در بیوژنز به نام  siRNAو miRNA تشخیص داده شده­اند. اینکه چگونه مسیرهای siRNA و miRNA می­نوانند در ایجاد مقاومت استفاده شوند در زیر بحث می شود.

الف) مسیرsiRNA :

در  مسیرsiRNA  ، خاموشی ژن بعد از رونویسی بوسیله RNA های ویروسی تک رشته­ای که بسیار ساخته شده­اند و یاRNA  های دو رشته­ای که توسط میزبان یا RdRp(RNA پلی مرازهای  وابسته به RNA) تولید شده آغاز می­شود. در گیاهانRNA  پلی مراز I وابسته به RNA و RDR6 برای خاموشی ویروس­ها و تراریخت­ها لازم است. اینRDR  پلی مرازها ازRNA  های تک رشته­ای به عنوان الگو برای تولیدRNA های دو رشته­ای استفاده می­کنند. اینRNA های دو رشته­ای به عنوان سوبسترا برای دایسر (یک نوع III Rnase) بکار می رود. دایسر می­تواند RNA دو رشته­ای را بهsiRNA های با طول 21-25 نوکلئوتید برش دهد. siRNAهای تولید شده با مجموعه­های خاموشی القاء شونده باRNA  (RISC) ادغام می­شوند که در نهایت برشRNA های هدف صورت می­گیرد. به صورت متناوب این مجموعه­ها می­توانند به درون مجموعه­های خاموش­کننده رونویسی که باRNA  القا می­شوند وارد شده تا کروماتین را بطور مستقیم از طریق متیلا سیون هیستون وDNA خاموش کنند. در مجموعه RISC , siRNA در میان اتصال شونده خاص توالی محل برشRNA های هدف واقع می­شوند. قطعات برش یافته در سیتوپلاسم توسط اگزونوکلئازها به طور کامل تجزیه می شوند. به طور متناوب siRNAها به عنوان پرایمر برایRDR  پلی مرازها برای رو نویسیRNAهای هدف مولد RNAهای دو رشته­ای و siRNAهای بیشتر استفاده می­شود. این RDR پلی مرازها فعالیت خزانه siRNAها را افزایش و در نتیجه آن خاموشی افزایش می­یابد.

آرابیدوپسیس حاوی چهار پروتئین دایسر (DSL) است. سه تا از آنها در مسیر siRNA هنگامی که DCL1 برای مسیرmiRNA لازم است، شرکت دارد. 2 DCL رونوشت آنتی سنس طبیعی مرتبط با تنش را سنتنز می­کند، DCL3 ، siRNA بیست و چهار نوکلئوتیدی درگیر در متیلاسیون و شکل­گیری هتروکروماتین را تولید می­کند و 4DSL ، siRNAفعال ترانس 21 نوکلئوتیدی، که حد فاصل خاموشی ژن بعد از رونویسی برخی از ژنهای درونزاد یا ترانسژن است را تولید می کند .

2 DCLو4DSL در تولید siRNA از برخی ویروس­ها مثل TCV، CALCUV ، CMV،TRV  درگیرند. بنابر مدارک اخیر پیشنهاد می­کند که پروتئین­های DCL نقش هم­پوشان و قابل تعویض در هر دو مسیر siRNA و miRNA دارند .

مقاومت با واسطه RNA در ویروس هایRNA  و  DNA:

مقاومت با واسطه RNA می­تواند مقاومت علیه گسترده وسیعی از ویروس­هایRNA  و  DNAرا ایجاد کند. در مقایسه با مقاومت بواسطه پروتئین پوششی، مقاومت بواسطهRNA  سطح بالاتری از مقاومت به ویروس را ایجاد می کند. به هر حال این نوع از مقاومت تنها علیه ویروس­هایی که توالی آنها رابطه نزدیکی با هم دارند ظاهر می­شود. و این مسئله به عنوان یک نقص برای مقاومت به ویروس در محصولات زراعی مطرح است. آلودگی توسط چند ویروس به طور معمول در شرایط مزرعه­ای رخ می­دهد. آلودگی با گونه­های ویروسی با توالی غیر مرتبط ممکن است بر مقاومت به واسطه RNA غلبه کند چون خاموشی ژن پس از رونویسی بوسیله­ی بازدارنده­های خاموشی از ویروس­های غیر مرتبط کاهش یافته یا به کلی متوقف می­شود. بنا بر این کار برد عملی این مقاومت نیاز به توسعه راهکار هایی دارد که مقاومت ویروسی به طیف وسیعی از ویروس­ها در مزرعه را ایجاد کنند.

جان و همکاران در سال 2000 سازه­ای ژنتیکی ساده با توالی­های بدست آمده از دو ویروس مشخص (TGMV، TSWV) ساختند. بیان تراریخت این ژن­ها توانست مقاومت بواسطه RNA علیه چندین ویروس ایجاد کند. به طور مشابه بوچر و همکاران 2006 نشان دادند که گیاهان گوجه فرنگی بیان کننده یک RNA سنجاق­سری شمیریک ساده و کوچک که شامل چهار قطعه ژنی توپسوویروس بود (TSWV،‌  GRS ،TCSV ،WSMOV) مقاومت علیه طیف وسیعی از توپسوویروس­ها را نشان داد.

مقاومت بواسطه RNA به عنوان یک راهکار موثر علیه ویروس­های DNA جمنی ویروس­ها مطرح شده است. ایبر (2007) دریافت که بیان ترانسژن siRNA جمنی­ویروس قبل از آلودگی ویروس حتما باعث ایجاد مقاومت به ویروس نمی شود. این مشاهدات وجود یک آستانه بیان siRNA قبل از اینکه ویروس از پایش و تولید حجم بحرانی ویروس­ها ( که در سراسر گیاه پخش خواهند شد ) فرار کند را پیشنهاد کرد.

از طرف دیگر بیان (2006) نشان داد که جمنی ویروس­ها می­توانند از مقاومت به واسطه RNA به خاطر همانندسازی اپی زومی فرار کنند. این دانشمند سطوح بالای متیلاسیون در DNA تراریخت و DNA ویروسی را در گیاهان آلوده با جمنی ویروس­ها مشاهده کرد.

به هر حال اثر خاموشی نمی تواند همانندسازی جمنی ویروس ممانعت کند به همین خاطر این رویکرد مقاومت به واسطه RNA نمی تواند بر روی ویروس­های DNA دارکارآ باشد.

مسیر میکرو RNA (miRNA) :

miRNA ها RNA های تک رشته­ای با 21 نوکلئوتید طول هستند که از پیرایش پیش ساز miRNA بوسیله دایسر بوجود می­آید. تجزیه تحلیل پیش سازهای miRNA مشخص کرده است که برای پیرایش صحیح توسط دایسر نیاز به یک ساختار صحیح ثانویه است . و به طور نمونه، پیش سازهای miRNA بواسطه جفت نشدن کامل (mismatching) توالی دارای ساختارهای شبهه سنجاق سری با حلقه در ساقه می­شود. مفهوم این جفت نشدن هنوز مشخص نیست اگر چه این جفت شدن ممکن است برای بیوژتر miRNA صحیح هنگامی که آنها می­خواهند در راهنمایی دایسر به پیرایش صحیح miRNA 21 نوکلئوتیدی درگیر باشند، لازم باشد.

در پرتروتوزوآها، رونوشت اولیه miRNA (miRNA pri-) چندین کیلو باز طول دارد و حاوی 5-cap  و دنباله پلی آدنین است . این رونوشت طویل بوسیله درشا (drosha) که یک ریبو نوکلئاز نوع III است پردازش می­شود. این پردازش با کوفاکتور ویژه آن DGCR8 حاوی دومین متصل شونده به RNA دو رشته­ای است که می­تواند محل اتصال RNA دو رشته ای و تک رشته ای را در رو نوشت اولیه miRNA (pri-miRNA) شناسایی کند و بنابراین drosha را برای پردازش دقیق رو نوشت اولیه و آزاد سازی یک قطعه 65 نوکلئوتیدی شبه سنجاق سر، پیش ساز miRNA (miRNA pri-) هدایت کند. بعد از این که premiRNA یا پیش­ساز miRNA بوسیله مجموعه 5-ran-GPT اکسپورتین به سیتوپلاسم منتقل شد بوسیله دایسر به miRNA بالغ تبدیل می شود.

سیر تکاملی miRNA در آرابیدوپسیس به طور کاملأ محافظت شده نیست زیرا ژن های کد کننده همو لوگ drosha و DGCR8 بوسیله یک همولوگ دایسر به نام پروتئین هسته ایDCL1  مهیا می­شود. DCL1 قادر است که پیش ساز miRNA را به miRNA بالغ پردازش کند. miRNA بالغ در سیتوسول به مجموعه RISC اضافه می شود. تاکنون 184 ژن miRNA در آرابیدوپسیس تالیانا تشخیص داده شده و چندین ژن از آنها تنظیم فعالیت­های نموی مهم گیاه را نشان داده­اند.

مقاومت به واسطه miRNA های مصنوعی (amiRNA) :

گزارشات نشان داده اند که تغییر چندین نوکلئوتیدی از توالی miRNA بیست و یک نوکلئوتیدی اثری بر روی سیر تکاملی و بلوغ آن ندارد. این یافته­ها امکان طراحی دوباره توالی miRNA برای رو نوشت­های خاص هدف که به طور ذاتی تحت کنترل miRNA نیستند را بوجود آورد. نیو وهمکاران در سال 2006 کاربرد بیوتکنولوژیایی، تکنولوژی amiRNA را در تحقیق درباره مقاومت ویروس­های گیاهی نشان داند. پیش سازpri-miR159a  برای تولید دو amiRNA که مکمل توانایی های ژنوم های دو ویروس گیاهی بودند، استفاده شد. (TUMV , TYMV) وقتی این دو ژن در سطح مناسبی بیان شدند مقاومت اختصاصی به هر دو ویروس بسته به بیان amiRNA همجنس مشاهده شد.

مقاومت به چند ویروس و غلبه بر اثر ات محیطی amiRNA :

در مزرعه آلودگی با چندین ویروس می تواند کارآیی ضد ویروسی را در محصولات زراعی تراریخت به خطراندازد. مثلا متوقف کننده­های ویروسی بیان شده از گونه های ویروسی دیگر می توانند مقاومت به واسطه amiRNA یا siRNA را ازبین ببرند. بیان همزمان دو پیش ساز amiRNA در یک رو نوشت برای تولید پیش ساز دوگانه amiRNA می­تواند برای تولید دو amiRNA و ایجاد مقاومت به دو ویروس مختلف استفاده شود. بنابراین راهکار amiRNA چندگانه می تواند به طور وسیع برای بهبود آلودگی های چند گانه در مزرعه به کار رود.

شرایط محیطی مثل رطوبت کم می تواند بر مقاومت بواسطه siRNA  تاثیر گذارد. همچنین گزارش شده است که ویروس و خاموشی RNA بواسطه انتقال ژن در رطوبت پایین کاهش داشته است و علت آن ممانعت از تجمع siRNA در سلول های گیاه، حشره، پستانداران در این شرایط بوده است. این حساسیت به رطوبت شکستن مقاومت به ویروس به واسطه siRNA درC 15ْ را توضیح می دهد. از طرف دیگر تجمع amiRNA به سختی در رطوبت پایین تحت تاثیر قرار می­گیرد و لاین  نو ترکیب بیان کننده amiRNA ها مقاومت ویروسی اختصاصی­شان را حتی در رطوبت پایین حفظ کردند.

محافظت متقاطع :

علاوه بر مقاومت بواسطه پروتئین وRNA ، محافظت متقاطع برای کنترل بیماری­های ویروسی استفاده شده است. این مقاومت در یک گیاه میزبان بوسیله آلودگی با یک نژاد ضعیف (ویروس های محافظتی ) یک ویروس القاء می­شود. در نتیجه­ی این آلودگی، گیاهان آلوده در آلودگی­های بعدی به نژاد های مرتبط  نزدیک با ویروس مقاومت می­کنند. ویروس­های محافظتی نقطه کلیدی برای محافظت متقاطع ویروس­های بیماریزا هستند. ویروس­های محافظتی، ویروس­های ضعیف شده­ای هستند که سبب ایجاد علایم خفیف یا بدون ایجاد علایم بیماری در گیاه هستند. یک بار آلودگی با نژاد ضعیف ویروس می تواند سبب ایجاد مقاومت در برابر ویروسهای بیماریزا را به همراه داشته باشد. برخی از دانشمندان یافته­اند که جهش در ممانعت کننده­های خاموشی و ویرسی می تواند علایم جدی را کاهش دهد. مثال آن جهش در ممانعت کننده­های خاموشی ویروسی HC-PRO  از پتی ویروس هاست. همچنین موتاسیون در قطعه 126 دالتونی رپلیکاز، دیگر ممانعت کننده خاموشی از ویروس PMMOV منجر به تقلیل علایم و ایجاد مقاومت متقاطع در گیاهان فلفل شد.

یک ویروس رشته منفی مهم، ویروس پژمردگی لکه­ای گوجه فرنگی (TSWV) است. در این ویروس، RNA ژنومی شدیداً با پروتئین نوکلئو کپسید پیوند خورده است. این پروتئین در بسته بندی RNA ویروسی و همچنین در بسته بندی RNA ویروسی و همچنین در تنظیم مراحل رونویسی تا همانند سازی در طی سیکل آلودگی، فعالیت می­نماید. با استفاده از این روش گیاهان تراریخت در توتون و گوجه فرنگی تولید شده­اند.

 پدیده محافظت متقاطع بسیار شبیه به پاسخ­های ایمنی در جانوران است. پاسخی که بوسیله واکسن ویروسی ضعف شده القاء می­شود. به هر حال گیاهان دارای چنین سیستم مشابهی نیستند و مکانیسم حفاظت متقاطع روشن نشده است. این مقاومت ممکن است بوسیله پروتئین،RNA  و یا ترکیبی از هر دو مکانیسم باشد.

محافظت متقاطع بوسیله پروتئین :

نقش پروتئین­های پوششی در پاسخ­های محافظت متقاطع در آزمایشات متفاوتی تجزیه و تحلیل شده اند.

1)گیاه N.sylvesteris با ویروس موزاییک تنباکو به طور سیستمیک آلوده شد و نواحی سبز تیره و روشن در برگ­ها رشد یافت. (نواحی موزاییکی در پس زمینه سبز برگ ) نواحی موزاییکی سبز روشن حاوی مقادیر بالاتری از TMV علیه مایه­کوبی با یک نژاد بیماریزای TMV که نکروزه کننده برگ بود مقاومت نشان می­داد در حالیکه منطقه سبز تیره حاوی مقادیر کمتری از ویروس TMV بود ونسبت به آن نژاد نکروزه کننده TMV مستعدتر بود. این نتایج نشان داد که حضور نژاد محافظتی برای مقاومت ضروری است. از طرف دیگر این مقاومت می تواند بوسیله آلودگی باRNA ویروسی بدون پوشش از بین برود.

2)نژاد بدون پروتئین پوششی TMV به نام DT-1G هیچ گونه محافظتی علیه نژاد نکروز کننده TMV ایجاد نکرد.

3)مشابه آنچه در مقاومت مرتبط با پروتئین پوششی دیده شد، موتانتهای متفاوت در پروتئین پوششی با افزایش یا کاهش اجتماع پروتئین پوششی ( وقتی وکتور ویروسی PVX به طور سیستمیک بیان شد ) نشان دادند که جهش یافته پروتئین پوششی با قابلیت اجتماع بالا، حفاظت متقاطع مناسبی را علیه آلودگی با TMV بوجود می­آورد. بنابراین حفاظت متقاطع TMV و مقاومت مرتبط با پروتئین پوششی می­تواند دلیلی بر توانایی پروتئین پوششی در ممانعت از بدون پوشش شدن ویروس­های مشکل­زا باشد.

4)دیتریچ و همکاران (2003) توزیع پتی ویروس­ها را که با فلور سنت­های متفاوتی نشاندار کرده و آنها را در آلودگی­های مخلوط شده­ای به گیاهان N. sylvestris انکوبه کرده بودند، بررسی کردند. گیاهان آلوده شده بوسیله هر کدام از مخلوط­های PVX/ PVYS علایم مشترکی با تعداد زیادی از گیاهان آلوده شده مضاعف که هر دو نوع فلورسنت را نشان می­دادند، نشان داده شد. بر عکس در مورد نژادهای PVYS که به صورت متفاوت و نشانمند شده بودند توزیع فلورسنت سبز و قرمز به صورت همبارز در سلول های آلوده تفرق نشان داد. این نتایج نشان داد که در آلودگی­های مختلط بوسیله ویروس­های مشابه اولین ویروس از آلودگی­های بعدی ویروس هم نژاد ممانعت می­کند در حالی که این موارد برای ویروس­های غیر مشابه صادق نبود. از این رو مکانیسم مقاومت بواسطه پروتئین می تواند برای محافظت متقاطع علیه ویروس­های مشابه استفاده شود. به طور جالب TMV بدون پوشش شده هنوز سبب محافظت متقاطع می­شود. که این مسئله می­رساند که ممکن است مکانیسم­های جایگزین دیگری که نیازمند محافظت بر پایه RNA هستند وجود داشته باشد.

محافظت متقاطع بواسطهRNA  :

برخی از ویروس های گیاهی مثلCAMV ,TBRV ,TRV  به عنوان ویروس­های القاء کننده ترمیمی طبقه­بندی می­شوند. این ویروس­ها منجر به ایجاد علایمی بر روی برگ­های آلوده می شوند اما علایم در برگ­های بالایی با گذشت زمان ترمیم می شوند. این ویروس­های تحریک کننده ترمیمی، خاموشی ژن با القاء ویروسی (VIGS ) را هدف قرار داده و محافظت متقاطع علیه نژادهای ویروسی با ارتباط نزدیک یا با توالی مرتبط در آلودگی­های بعدی را به گیاه می­بخشد. برای مثالTRV-GFP  خاموشی ژن با القاء ویروسی را تحریک کرده و محافظت متقاطع علیه PVX-GFP ایجاد می­کنند. و همچنینTBRV  می­تواند خاموشی ژن با القاء ویروسی را تحریک کرده و محافظت متقاطع علیه PVX-W22 که حامل قطعه­ای از ژنوم TBRVاست، بوجود آورد. این یافته­ها از این نظریه حمایت می­کند که مکانیسم با واسطه RNA رادر محافظت موثر می­داند.

به طور جالبی، نژاد ملایم ویروس ZYM به نام GAC که دو جهش در موتیف محافظت شده HC-PRO دارد علایم فتوتیپ ترمیمی را در کدو القاء می­کند در حالی که نژادWTZYM  سبب بروز علایم شدید بیماری می­شود. گیاهان آلوده شده با WT و موتانت GAC هر دو علایم را نشان دادند و تیتر ویروس در 5dpi افزایش یافت. در هر حال بین 5-10  dpiبرگ­های سیستمیک گیاهان آلوده شده با GACعلایم بیماری را از دست دادند و تیتر GACکاهش یافت در حالی که تیتر نژاد WT در 5dpi به سرعت افزایش یافت و سپس به یک سطح ثابت رسید این مسئله نشان داد که کارایی محافظت متقاطع با روز های بعد از آلودگی ویروس محافظتی و با تیتر GAC مرتبط است بویژه اگر گیاهانی که با GAC آلوده شده بودند با یک نژاد بیماریزای شدید بعد از 5dpi آلوده می­شدند، مقاومت کاملی بدست می­آمد، گیاهان آلوده با GAC مقاومتی ناقص یا علایم شیمیریک نشان می دادند.

احتمال دارد که GAC خاموشی ژن با القاء ویروسی را برای ایجاد مقاومت علیه نژاد بیماریزای شدید (WT) هدف قرار داده و جهش یافته HC-Pro نتواند به طور کارآیی از خاموشی ژن با القاء ویروسی ممانعت کند که در نهایت منجر به کاهش تیتر GAC بعد از 5dpi می شود. به طور تعجب آوری، جهش یافته HC-Proدر GAC به طور کامل توانایی خود مبنی بر ممانعت از خاموشی ژن را از دست نداده بود اما وقتی GAC در گیاهان نوترکیب تزریق شد ممانعت از خاموشی ژن با القاء ویروسی ادامه یافت. بنابراین پاسخ­های متعددی می­تواند در محافظت متقاطع درگیر باشد. که نمی­توانند به سادگی و با یک مکانیسم ساده توضیح داده شوند.

مکانیسم های چند گانه محافظت متقاطع :

مقدار کمی از نژاد های ویروسی ضعیف در محافظت متقاطع گیاهان آلوده شده با GAC حاصل می­شود. این RNAهای ویروسی ممکن است هدف قرار گرفته و به طور پیوسته خاموشی ژن با القاء ویروسی را حفظ کرده و مقاومت علیه آلودگی نژاد بیماریزای جدی را ایجاد می­کنند. علاوه براین پروتئین پوششی نژاد ضعیف در سلول­های گیاهی وجود دارد و بنابراین ممکن است بدون پوشش شدن نژاد ویروسی ویژگی بیماریزایی شدید را متوقف کنند. ممانعت کننده­های ویروسی جهش یافته مثل HC-Pro  ممکن است با چرخه زندگی نژاد ویروسی با ویژگی بیماریزایی شدید بوسیله اثر منفی غالب تداخل ایجاد کند. در این مورد محافظت ناقص، توضیحات تیتر نژاد های ضعیف و قوی اثر دفع متقابل را نشان می دهد. این دفع متقابل پیشنهاد می کند که دو ویروس در آلودگی هم زمان گیاه با هم رقابت می­کنند به هر حال این امکان وجود دارد که نژاد ضعیف پاسخ ایمنی اولیه گیاه را با مکانیسم­های ناشناخته دیگری را در گیاه راه اندازی کند. به طور خلاصه محافظت متقاطع بوسیله مجموعه­ای از مکانیسم­های دفاعی متنوع صورت می گیرد. این مکانیسم­ها شامل مقاومت بواسطه RNA و پروتئین و همچنین شامل پاسخ­های ایمنی گیاه و رقابت ویروس - ویروس می­باشد.

حفاظت با RNA ماهواره­ای Satellite RNA protection  :

RNA های ماهواره­ای، گروهی از RNAهای تک رشته­ای کوچک( تقریباً 300 نوکلئوتید) هستند که برای همانند سازی و بسته بندی ویریونی به منظور ایجاد آلودگی در جای دیگر به یک ویروس کمکی (Helper virus) وابسته می­باشند. بنابر این RNA ماهواره­ای برای تکثیر و انتقال به ویروس وابسته است، اگر چه وابسته به ژنوم ویروس نیست. این گونه RNA ماهواره­ای با چندین ویروس دیگر مرتبط هستند. تعدادی از RNAی ماهواره­ای تکثیر و علایم ویروس کمکی خود را تعدیل می­نمایند. بسته به RNAی ماهواره­ای مرتبط، طیف تغییر در ایجاد علایم از نکروز شدید تا کم اثر شدن شدید آن می­باشد. بنابر این RNAهای ماهواره­ای که علایم را تغییر می­دهند می­توانند به طور بالقوه برای کاهش شدت بیماری ویروس کمکی مورد استفاده قرار گیرند. بدین جهت کاربرد آن در گیاهان تراریخت برای ایجاد مقاومت در گیاهان زراعی از جایگاه مهمی برخوردار گردیده است. تاین و همکاران در سال 1991 نشان دادند که تلقیح عمدی یک نژاد ویروس موزاییک خیار CMV حاوی یک RNAی ماهواره­­ای تقلیل دهنده­ی علایم، گیاهان توتون، فلفل، گوجه فرنگی و خیار را به طور موفقیت­آمیزی در برابر یک نژاد بیماریزای CMV محافظت نمود و میزان خسارت را کاهش داد.

تاین و گوسوی در سال 1991 گزارش کردند که 121 گیاه گوجه فرنگی تراریخت بیان کننده­ی یک RNA ماهواره­ای تقلیل دهنده­ی علایم CMV، در نقایسه با گیاهانی که یک نژاد قوی CMV به آن­خا تزریق شد، 50% عملکرد بیشتری تولید کردند. این راهکار مربوط به آن دسته از سیستم­های ویروسی است که دارای RNAی ماهواره­ای تقلیل دهنده هستند. کیم و همکاران فلفل­های قرمزی تولید کردند که RNA ماهواره­ای CMV را بیان کردند. کاهش علایم ویروسی در نتاج این گیاهان، پس از تلقیح با نژادهای CMV-Y یا CMV-Korea تایید گردید.

مقاومت بواسطه­ی سنس (sense) و آنتی سنس (Antisense):

استراتژی دیگر الگو گرفته از پاتوژن که برای کنترل ویروس­های گیاهی مورد بررسی قرار گرفته است، بیان ترانسژن آنتی سنس و جدیداً قطعات سنس RNAهای ویروسی می­باشد. اساس این راهکار، اتصال RNA ویروسی با توالی­های RNA مکملی است که توسط گیاه بیان می­شود. جفت شدن نامناسب RNA-RNA، از در دسترس بودن RNA ویروسی برای همانند سازی و بیان ژن، ممانعت می­نماید. بنابر این ساختارهای آنتی­سنس و سنس می­توانند برای بلوکه کردن مراحل اولیه مهم که در ایجاد آلودگی مهم هستند، مورد استفاده قرار گیرند. حفاظت آنتی سنس، در توتون که RNA مکمل پروتئین پوششی ویروس را بیان می­کند نشان داده است.

مقاومت به واسطه­ی پروتئین­های حرکتی Movement protein

پروتئین­های حرکتی برای جا به جایی سلول به سلول ویروی­های گیاهی ضروری هستند. این پروتئین­های حرکتی نقش دریچه­ی پلاسمودسماتا را تغییر و بدین جهت اجازه انتقال اجزا ویروس یا مشتقات نوکلئوپروتئین به سلول­هی مجاور را می­دهند.

اساس مقاومت حاصل از پروتئین­های حرکتی بدین­گونه است که ار ژن­های جهش یافته­ی پروتئین حرکتی برای تولید پروتئین حرکتی با عملکرد نادرست استفاده می-شود در نتیجه این پروتئین ناقص باعث مداخله در فرآیند انتقال و در نهایت باعث تضعیف با تاخیر در آلودگی ویروس می­شود. در خقیقت مقاومت حاصله بر اساس رقابت میان دو پروتئین حرکتی ویروس بیماریزا و نوترکیب برای اتصال به جایگاه پلاسمودسماتا می­باشد. در گیاهان تنباکو چنین مقاومتی با استفاده از بیان نوترکیب پروتئین حرکتی ناقص TMV در برابر TMV و ویروس موزاییک brome حاصل شد.

منبع:

http://agriculturalbiotechnology.persianblog.ir