استفاده از نانوذرات به عنوان نشانگر در تشخیص های مولکولی به جای نشانگرهای فعلی از جمله نشانگرهای فلورسنت، باعث افزایش حساسیت، قابلیت انتخاب و ظرفیت چندبعدی گردیده است. روش های بر پایه این نانوذرات، نسبت به روش های رایج تشخیص مولکولی مزایای زیادی دارند. این مقاله مروری، بر آخرین پیشرفت ها در زمینه استفاده از نانوذرات به عنوان نشانگر، به ویژه در بیوحسگرها، برای تشخیص اسیدهای نوکلئیک و پروتئین هاست.
مقدمه
روش های رایج تشخیصی DNA، بر پایه PCR و استفاده از مولکول های فلوروفور معدنی به عنوان نشانگر استوار است. این روش ها بنا به دلایلی از جمله طیف های جذبی و نشری وسیع و تجزیه ناهمگون مولکول های فلوروفور معدنی، دقت تشخیص بالایی ندارند. همچنین نیازمند تجهیزات پرهزینه و پیچیده هستند [۱و۲].امروزه روش های رایج تشخیص پروتئین ها عمدتابر اساس استفاده از ELISA طراحی شده است. در این جا با وجود مشکلاتی مشابه حالت قبل علاوه بر نیاز به تجهیزات زیاد برای تکثیر پروتئین هایی که در مقادیر کم هستند، یافتن روشی که با روش های معمولی مثل ELISA امکان پذیر نیست، ضروری است [۱و۲].
در طول دهه گذشته پیشرفت های زیادی در استفاده از روش های نانو جهت تشخیص مولکولی حاصل شده است و تلاش ها بیشتر در جهت طراحی بیوحسگرها (Biosensors) برای تشخیص دقیق، حساس، انتخابی و کاربردی مولکول های زیستی می باشد [۳]. امروزه در بیوحسگرها برای تشخیص اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها، به طور وسیعی از نانوذرات استفاده می شود. این ذرات به دلیل دارا بودن اندازه نانو و خصوصیات فیزیک وشیمیایی قابل تغییر و تنظیم (از جمله خواص الکتریکی، الکتروشیمیایی، نوری و مغناطیسی)، کاندیدای خوبی برای جایگزینی با دیگر مولکول های رنگی رایج به عنوان نشانگر در تشخیص مولکولی هستند [۱و۳و۴ ]. نانوذرات در نقش نشانگر ،حساسیت، سرعت و انعطاف پذیری تست های بیولوژیکی را جهت اندازه گیری حضور یا فعالیت مواد افزایش می دهند. از طرفی، چون در استفاده از این ذرات حجم کوچکی از نمونه نیاز است، برخی از روش های طراحی شده بر پایه نانوذرات، نیاز اولیه نمونه به تکثیر ماده مورد اندازه گیری را از جمله PCR برطرف می کند. امتیاز دیگر نانوذرات داشتن کارآیی تشخیص میکروارگانیسم ها، بافت های سرطانی و غیره را هم در شرایط داخل بدن (in vivo) و هم در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) دارا می باشند [۱و۲و۳ ].در اینجا از میان انواع نانودراتی که تاکنون طراحی و مطالعه شده است، چهار نوع نانوذره مهم که به عنوان نشانگر در تشخیص مولکولی (DNA و پروتئین) کاربرد دارند، بررسی خواهد شد. اساس تقسیم بندی این ذرات بر اساس سازوکار بازخوانی (Readaut)آنهاست.
نانوذرات طلا
اندازهاین ذرات سه تا صد نانومتر بوده و به دلیل اینکه روش های اندازه گیری متعددی همچون جذب نوری، فلورسانس، پخش رامان، نیروی مغناطیسی و جریان الکتریکی می توانند برای تشخیص آنها به کار روند، نشانگرهای خوبی در طراحی بیوحسگرها می باشند. از این ذرات در تشخیص DNA ، پروتئین، میکروارگانیسم ها و غیره استفاده می شود. تشخیص DNA با استفاده از نانوذرات طلا نسبت به سیستم های تشخیص ژنومی رایج ده برابر حساسیت و صدهزار برابر ویژگی بیشتری دارد [۱و۳و۵].
روش هایی که در آنها بازخوانی، به روش نورسنجی (Optical) صورت می گیرد
از خصوصیات نوری و دمایی پروب های نانوذرات طلای جدا از هم و مجتمع، (aggregated) به عنوان یک روش تشخیص استفاده می گردد. میان کنشِ ویژه موجود در بین اولیگونوکلئوتیدهای تثبیت شده (DNA Probe) روی نانوذرات طلا و DNA هدف (DNA target) باعث تجمع (assembly) نانوذرات طلا به شکل شبکه ای متصل به هم و در نتیجه تغییر رنگ می شود. این تغییر رنگ به واسطه خصوصیات پخش، میان کنشِ بین پلاسمون های سطح ذره و تغییر فاصله بین نانوذرات طلا ایجاد می گردد. این تغییر رنگ نشان دهنده وجود مولکول هدف در نمونه بوده و به روش چشمی هم قابل مشاهده است. این شبکه متشکل از تجمع نانوذرات به وسیله هیبریدشدن پروب های نانوذرات طلا با مولکول هدف، در درجه حرارت های مختلف، باعث ایجاد تغییر رنگ ناگهانی (sharp) می شود [۱و۵].
با انتقال مخلوطی از مجتمعات ایجاد شده بین DNA تثبیت شده، زنجیره مکمل آن و رشته هایی با درجات متفاوتی از تغییر توالی (نسبت به زنجیره مکمل) بر روی TLC در دماهای مختلف، می توان الگوی استانداردی برای ارزیابی میزان هیبرید شدن در دماهای مختلف به دست آورد. با استفاده از این خصوصیات رنگ و دما می توان به روشی برای تشخیص وجود جهش در DNA هدف موجود در نمونه مورد بررسی، پی برد. به عبارت دیگر از این روش می توان برای تشخیص SNPs و دیگر mismatchs استفاده کرد [۱و۵].
حساسیت تشخیص روش های رنگ سنجی با احیای نقره (Ag) به وسیله نانوذرات طلا افزایش می یابد. روش روبش گری (Scannometry)، یک روش سنجش ساندویچی و شامل رشته DNA متصل به یک بستر
(یا DNA Chip)، یک توالی هدف و یک پروب نانوطلاست. اتصال مولکول های هدف و پروب نانوطلا به توالی متصل به بستر، یک سری لکه های خاکستری (gray spot) را ایجاد می کند که ویژه مولکول هدف بوده و غلظت نمونه را نیز نشان می دهد. شدت رنگ این لکه ها با یک روبش گر (scanner) و یا حتی چشم غیر مسلح، قابل تشخیص است. در صورت استفاده از نقره، با احیای آن روی نانوذرات طلا، می توان حساسیت تشخیص را بالا برد [۵ و۶]. با استفاده از نانوذرات مختلف طلا (و در نتیجه رنگ های مختلف) تشخیص همزمان چندین مولکول هدف میسر می گردد. این روش تشخیص مولکولی چهار برابر ویژگی بالاتر و صد برابرحساسیت بیشتر از روش های فلوریمتری رایج دارد[۶].
یک مثال برای این روش، بارکد زیستی (Bio barcode) است. بارکد زیستی، یک توالی DNA ساختگی و انتخابی برای یک توالی DNA هدف است که از آن برای تشخیص DNA یا پروتئین در نمونه های بیولوژیک استفاده می شود.
الف) تشخیص DNA
در این روش ابتدا یک زنجیره DNA با توالی دلخواه (Bar Code DNA) طراحی و رشته مکمل آن نیز ساخته و پس از فعال شدن، بر روی نانوذرات طلا نشانده می شود. همچنین رشته DNA دیگری که مکمل بخشی از DNA هدف (آنچه قرار است در نمونه شناسایی شود) است، پس از فعال شدن بر روی نانوذره طلا تثبیت می شود. سپس اجازه هیبرید شدن رشته بار کد با DNA مکمل داده می شود. از طرفی رشته سوم DNA که مکمل بخش دیگری از DNA هدف است، پس از فعال شدن بر روی ذرات مغناطیسی تثبیت می شود. با قرار گرفتن این دو ذره در محلول، اگر DNA هدف وجود داشته باشد، حتی در مقادیر بسیار اندک، موجب اتصال این دو ذره به یکدیگر می شود. در مرحله بعد با توجه به خاصیت مغناطیسی ذره دوم، می توان آنها را از محلول جدا کرد و بعد با استفاده از عواملی (مثل ترکیبات دناتوره کننده) که دو رشته DNA را جدا می کنند، DNA بار کد را از مکمل آن جدا و شناسایی کرد. حتی می توان از ترکیباتی مثل نقره که حساسیت تشخیص را بالا می برند نیز استفاده کرد. به این ترتیب مقادیر بسیار اندک از یک توالی DNA بدون نیاز به PCR قابل شناسایی و حتی اندازه گیری است [ ۷].
ب) تشخیص یا اندازه گیری پروتئین با استفاده از Bar Code DNA
در این روش نیز همانند روش قبل، از یک توالی انتخابی و مکمل آن که بر روی نانوذرات طلا نشانده شده، استفاده می شود. همچنین آنتی بادی پلی کلونال علیه پروتئین مورد اندازه گیری بر روی این ذرات طلا تثبیت می شود. این آنتی بادی ها بر روی ذرات مغناطیسی نیز نشانده می شود. حال با وارد کردن این دو ذره در محلول حاوی پروتئین مورد نظر، پروتئین به آنتی بادی موجود در سطح هر دو ذره متصل شده و آنها را به یکدیگر متصل می کند. پس از شستشو و حذف سایر مواد، با توجه به خاصیت مغناطیسی ذره دوم، می توان آن را از محلول جدا و همانند روش قبلی، پس از جدا کردن رشته DNA بار کد از مکمل آن با استفاده از مواد دناتوره کننده DNA بار کد را، که نمادی از حضور پروتئین مورد نظر در نمونه است شناسایی و انداره گیری کرد [ ۸]. به این ترتیب مقادیر بسیار اندک پروتئین در نمونه قابل شناسایی است.
آخرین بحث مربوط به بازخوانی نوری نانوذرات طلا، ترکیب نانوذرات طلا با رنگ های رامان است که پخش رامان به وسیله نانوذرات طلا (SERS) را افزایش می دهد و به افزایش سیگنال برای مولکول های جذب شده در سطوح زبر فلز، به ویژه نقره و طلا مربوط می شود. این افزایش سیگنال از طریق دو ساز و کار تقویت موضعی میدان الکترومغناطیسی در الکترون آزاد فلز و اثر شیمیایی روی مولکول جذب شده در سطح فلز به وسیله نانوذرات طلا صورت می گیرد. محدوده تشخیص، در محدوده طیف رامان بوده و به صورت اثر انگشت های طیف رامان ظاهر می گردند. رنگ های رامان به دلیل باندهای جذبی باریک، تهییج از سوی لیزر و محدوده طیف رامان، قادر به افزایش سیگنال تشخیص در محدوده طیف های رامان می گردند. با این روش محدودیت لکه های خاکستری حاصل از روش روبشی(Scanometric) بر طرف شده، استفاده همزمان از چندین رنگ رامان در تشخیص چند مولکول امکان پذیر می گردد [۵ و۶]. نانوذرات طلا همچنین به عنوان داربست (Scafold) و فرونشاننده های quenchers نشر فلورسانس در تشخیص همگن اسیدهای نوکلئیک عمل می کنند [۱]. قطعات الیگونوکلئوتید به یک ترکیب دارای نشر فلورسانس (فلوروفور) متصل می شوند. سپس این رشته ها به نانوذرات طلا متصل می گردند، به طوری که به صورت تک زنجیره به ذره طلا نزدیک شده و نشر نداشته باشند. پس از اینکه این ذره در محلول حاوی DNA هدف قرار گرفت، در صورت تشکیل هیبرید، دو ماده فلوروفور از یکدیگر فاصله گرفته، نشر فلورسانس قابل مشاهده و آنالیز می شود.
تشخیص الکتریکی مولکول های زیستی با استفاده از نانوذرات طلا
یکی از روش های ساده شناسایی DNA هدف، تشخیص الکتریکی است. در این روش پروب های DNA روی صفحاتی با اندازه میکرون (chip) در بین دو الکترود، تثبیت می گردد. این پروب ها طوری طراحی می شود که مکمل نیمی از DNA هدف باشد. همچنین طراحی پروب های نانوطلا به گونه ای است که الیگونوکلئوتید آن مکمل نیمی دیگر از DNA هدف باشد. هیبرید شدن DNA هدف با پروب های نانوطلا و پروب تثبیت شده بر روی سطح، باعث می شود که نانوذرات طلا در حدفاصل بین دو الکترود قرار گیرند. با افزودن نقره، کمپلکس تشکیل شده بین دو الکترود، فلز نقره را به داخل کشیده و پلی بین دو الکترود ایجاد می شود. از تغییر جریان حاصل می توان برای تشخیص حضور DNA هدف، استفاده کرد. دقت این روش در حد ۵۰۰ فمتو است و از آن در سنجش های ایمنی نیز استفاده می گردد [ ۵ و۹].
تشخیص مولکول های زیستی با استفاده از خواص الکتروشیمیایی نانوذرات طلا
خاصیت احیاکنندگی نانوذرات طلا باعث شده است که از آنها به عنوان نشان های الکتروشیمیایی در تشخیص اسید نوکلئیک استفاده گردد. هیبرید شدن DNA هدف روی الکترود تثبیت شده با پروب های نانوطلا یک موج اکسایش طلا در حدود ۲۷/۱ ولت ایجاد می کند. تشخیص حضور یک جهش منفرد یا پلی مورفیسم تک بازی (SNP)، همچنین شناسایی بازهای درگیر، با استفاده از نوکلئوتیدهای نشاندار با نانوذرات طلا امکان پذیر می گردد [۱ و ۵]. ابتدا الیگونوکلئوتید مکمل با DNA هدف بر سطح الکترود تثبیت می شود. آن گاه محلول بیولوژیک حاوی DNA هدف به آن اضافه و هیبرید تشکیل می شود. اگر نمونه حاوی DNA دارای حتی یک جهش نیز باشد، چون تشکیل پیوند هیدروژنی در آن ناحیه صورت نمی گیرد، در ناحیه جهش، باز (ها) آزاد است. حال ، نانوذرات طلای متصل به تک تک نوکلئوتیدها، مرحله به مرحله به این نمونه ، افزوده می شود. در صورت اتصال نوکلئوتید متصل به نانوذره طلا به باز مکمل (که نشانگر وجود جهش در DNA هدف است) ، موج اکسایش طلا به طریق الکتروشیمیایی قابل مشاهده و اندازه گیری است.
برهنه سازی الکتروشیمیایی (Stripping voltametry)
یک پروتکل اندازه گیری الکتروشیمیایی حساس است که در اندازه گیری آثار عناصر فلزی در مایعات زیستی (خون، ادرار، بزاق)، بافت ها (دندان و مو)، فراورده های غذایی (نوشابه ها وآب) و نمونه های زیستی (آب دریا و رودها) کاربرد دارد. آنالیزهای بر پایه برهنه سازی الکتروشیمیایی از دو مرحله پیش تغلیظ، سپس برهنه سازی تشکیل شده است. در مرحله پیش تغلیظ، نمونه محلول در حجم کوچکی از الکترود قرار می گیرد که در حقیقت برای بررسی محلول های tracer به کار می رود. در محلول پیش تغلیظ Electrodeposition انجام می شود که آنالیت با انجام واکنش از محلول به داخل الکترود تغلیظ می شود و پس از این مرحله، مرحله برهنه سازی با استفاده از روش ولتامتری انجام می شود که طی آن آنالیت تغلیظ شده با انجام واکنش عکس مجدداً حل و اندازه گیری می شود. به دلیل تغلیظ نمونه با فاکتور صد تا هزار برابر در الکترود، جریان اندازه گیری شده کمتر تحت تأثیر جریان خازنی یا جریان باقی مانده ناخالصی قرار می گیرد. تقویت سیگنال، با استفاده از سوارکردن چندین نانوذره طلا، سپس نانوذرات نقره بر روی یک بستر پلیمری به دست می آید. نانوذرات بعداً می توانند به طور آنزیمی حل و به وسیله برهنه سازی الکتروشیمیایی اندازه گیری شوند. از این روش در تشخیص پروتئین و DNA استفاده می گردد[۱ و ۵]. ابتدا یک آنتی بادی پیگردی روی یک ذره مغناطیسی قرار می گیرد که به آنتی ژن هدف می چسبد. آنتی بادی تشخیصی که روی نانوذره طلا سوار شده است اضافه می شود، سپس نانوذره نقره افزوده می شود. نانوذره طلا باعث احیای نانوذره نقره می گردد. کمپلکس نانوذرات و Ag Ab روی یک مگنت قرار گرفته و نانوذرات روی الکترودها تغلیظ می شوند. با اعمال پتانسیل، نانوذرات رسوب کرده جدا شده و به روش برهنه سازی الکتروشیمیایی تشخیص و اندازه گیری می شوند که تغییر جریان با غلظت نمونه برابر است.
نقاط یا ذرات کوانتومی
نانوکریستال های مواد نیمه رسانا از قبیل سلنید و کادمیم، نانوابزار دیگری برای تشخیص آزمایشگاهی محسوب می شود. این کریستال های نیمه رسانا به عنوان منابع نور مولکولی عمل می کنند و خصوصیات آنها به اندازه و شکل شان وابسته است. به محض اتصال یک آنتی بادی یا دیگر مواد تثبیت شده روی ذرات کوانتومی به مولکول هدف مورد نظر، نقاط کوانتومی شبیه beacon در اثر عمل اتصال، نور ساطع می کنند. امروزه ذرات کوانتومی به دلایلی از قبیل نشر وابسته به اندازه ذره، درخشان تر بودن، تجزیه نشدن در برابر نور، تهییج همزمان چندین رنگ، تهییج ساده و حساسیت بالا مورد توجه قرار گرفته اند [۱۰ و ۱۱].
تولید پروب های نقاط کوانتومی
سنتز: این نقاط یا ذرات عمدتاً از صدها تا هزاران اتم عناصر گروه دو و شش جدول تناوبی (مثل CdTe وCdSe) و یا عناصر گروه سه و پنج (مثل InP و InAs) به صورت دوفازی یا سه فازی تهیه می گردند که این سیستم دوعنصری موجب ایجاد حالت نیمه رسانایی این ترکیبات می شود. ذرات کوانتومی از یک هسته (core) نیمه رسانای فلورسانس (مثل CdSe، CdTe، InP و یا InAs) و یک پوسته ظریف از یک ماده با باند انرژی بیشتر (مثل CdS، ZnS و یا ZnSe) تشکیل شده اند. این پوسته باعث پایداری هسته در برابر نور شده، از خاموشی سطحی تهییجات جلوگیری می کند و در نتیجه بازدهی کوانتوم را افزایش می دهد [۱۰ و ۱۱]. حلال های آلی از قبیل تری ان اکتیل فسفین (TOPO ) و هیدروکسیل آمین جهت حفظ خصوصیات نوری ذرات کوانتومی و محافظت هسته از محیط اطراف به عنوان پوشش (cap) به کار می روند. ترکیباتی مثل پلی اتیلن گلیکول (PEG) یا گروه های کربوکسیلات باعث حل شوندگی این ترکیبات می گردند. مرحله آخر تولید این ذرات، مزدوج کردن (کنژوگاسیون) آنها به لیگاندهای بیولوژیک از قبیل پپتیدها و اولیگونوکلئوتیدها برای اتصال به ترکیبات هدف است که این کنژوگاسیون می تواند به اشکال مختلف از جمله اتصال کوالانی، اتصال قطعه آنتی بادی به ذرات کوانتومی از طریق آمین سولفیدریل، کنژوگاسیون آنتی بادی ها به ذرات کوانتومی از طریق پروتئین آداپتور و اتصال پپتیدهای منتهی به هیستیدین و پروتئین ها به ذرات کوانتومی حاوی Ni NTA باشد[۱۰ ].
لازم به توضیح است که ذرات کوانتومی زمانی نور را جذب می کنند که انرژی برانگیختن بیشتر ازانرژی Bandgap باشد. در طول این فرایند الکترون ها از لایه ظرفیت به لایه هدایت منتقل می شوند. نشر وابسته به ذرات کوانتومی به شیوه on off عمل می کند که وابسته به قدرت برانگیختگی است و این پدیده احتمالاً از فوتویونیزاسیون و خنثی شدن بار نانوکریستال ها ناشی می شود[۱۱].
نانوذرات کوانتومی به دلایل مذکور کاربردهای وسیعی پیدا کرده اند که از جمله این کاربردها می توان به موارد زیر اشاره کرد[۳]: Immunohistochemistry، تشخیص و تعیین ژنومی، تشخیص مارکرهای زیستی، تشخیص اولیه سرطان، تشخیص میکروارگانیسم های عفونی مثل مالاریا و HIV، سنجش های خون کامل، تشخیص حساس RNA ویروسی در حد صد کپی، سنجش های ایمنی و تصویرسازی از بافت زنده و... .
تشخیص نوری مولکول ها به سیله ذرات کوانتومی
ذرات کوانتومی به دلیل داشتن ضریب جذب مولی بالا بسیار درخشان تر از سایر مولکول های فلوروفور هستند، همچنین به دلیل داشتن پایداری بیشتر در مقابل نور، طیف جذبی وسیع و نشری باریک، کاندیدای خوبی جهت تشخیص مولکول ها در شرایط in vivo محسوب می شوند. از این خصوصیات نوری ذرات کوانتومی در شرایط in vivo برای تشخیص گیرنده های سطح سلولی، اجزای اسکلت سلولی و آنتی ژن های هسته ای در نمونه های مختلف شامل سلول های زنده، سلول های تثبیت شده و برش های بافتی استفاده می شود[۱و۳ و۱۰و۱۱و۱۲].[ ۱].
تشخیص مولکولی بر پایه خصوصیات الکتروشیمیایی ذرات کوانتومی
ذرات کوانتومی دارای خصوصیات احیاکنندگی هستند. از ذرات کوانتومی با پتانسیل های اکسیداسیون مختلف جهت تشخیص همزمان چندین مولکول هدف استفاده می گردد[۱,۱۱].
نانوذرات مغناطیسی
پروب های نانوذرات مغناطیسی یک کلاس جدید از عوامل کنتراست و پیگردی (tracking) جهت تصویرسازی پزشکی هستند [ ۱۳و۱۴]. ساختمان این ذرات شامل یک هسته (حاوی ترکیباتی مثل اکسید آهن اَبَرپارامغناطیس (SPIO)، نیکل و یا کبالت) بوده که امروزه بیشتر از SPIOs به دلیل نداشتن خاصیت سمی استفاده می شود. در ساختمان این نانوذرات پوششی (coating) از دکستران یا پلی اتیلن گلیکول نیز وجود دارد که از تجمع (aggregation) این نانوذرات جلوگیری و باعث حل شوندگی آنها در آب و آماده شدنشان برای کونژوگه شدن می شود. نانوذرات با SPIOs، بنا به دلایلی از جمله غیر سمی بودن، نداشتن خاصیت ایمنی، اندازه کوچک، خاصیت مغناطیسی بالا، قابلیت تنظیم برای ارگان های هدف ویژه با تغییر در اندازه، ضخامت پوسته، شیمی سطحی و لیگاند هدف بیشتر استفاده می شوند. در کاربردهای in vivo نانوذرات آهن اکسید مگمیت و مگنیت به عنوان عوامل کنتراست در تصویرسازی های MRI و NMR استفاده می شود[۱۳] این ترکیبات تصویر حاصل از MRI و NMR بافت هدف را در نتیجه به هم زدنRelaxation Time آب اطراف تیره تر از سایر قسمت ها می کنند و در شرایط in vivo بافت هایی مثل کبد، طحال، مغز استخوان و گره های لنفاوی که حاوی ماکروفاژ بیشتری هستند عوامل کنتراست مغناطیسی را بیشتر به دام می اندازند و از این خاصیت در داخل بدن برای پیگیری بیماری های این اعضا، به خصوص موارد التهابی به صورت فرایندهای فیزیولوژیک استفاده می کنند. چون در بافت های سرطانی، این فرایندهای فیزیولوژیک ماکروفاژها را جذب نمی کنند پس در NMR رنگ درخشانتری را نشان می دهند
[۱۴]. به منظور افزایش ویژگی پروب های نانوذرات مغناطیسی به بافت هدف، لیگاندهای خاص مولکول یا بافت هدف همراه با یکسری عوامل در سطحشان که به آنها اجازه عبور از سلولها را می دهند طراحی می گردند[ ۱و۱۴]. از نانوذرات مغناطیسی در ایمنواسی ها نیز استفاده می شود[ ۱۳و۱۴].
Magnetorelaxometry، روشی است برای سنجش که ویسکوزیسته مغناطیسی یا Relaxation حرکت مغناطیسی یک سیستم نانوذره مغناطیسی را پس از خاموش کردن میدان مغناطیسی اندازه گیری می کند. در این سنجش ها آنتی ژن های هدف در سوسپانسیونی از آنتی بادی نشاندار با مگنت مخلوط می گردند و با اعمال یک میدان مغناطیسی، ذرات نانو خاصیت مغناطیسی خالص پیدا کرده که با خاموش کردن میدان مغناطیسی،Relaxation پیدا می کنند. تشخیص اتصال پروب به مولکول هدف با استفاده از تمایز فرایندهایRelaxation به دست می آید؛ نانوذرات غیر متصل سریعاً چرخش براونی ( Brawnian) پیدا می کنند، در حالی که نانوذرات متصل به مولکول هدف به آهستگی دچار Relaxation Neel شده و یک حرکت مغناطیسی ایجاد می نمایند که آشکارساز (Dtector) آن را ثبت می گردد. این روش علاوه بر امکان پذیر ساختن توانایی تشخیص و تمایز نشانگرهای متصل و غیر متصل به مولکول هدف نیاز به جداسازی نمونه را نیز بر طرف ساخته و در نتیجه اجازه تشخیص همگن ماده را می دهد [۱۳و۱۵].
نانوذرات سیلیکا
نانو ذرات سیلیکا؛ ذرات رنگی در اندازه های دو تا ۲۰۰ نانومتر هستند و ساختمانشان از تشکیل تعداد زیادی مولکول های رنگی در داخل یک ماتریکس سیلیکا است. سیگنال فلورسانس این ذرات ده هزار بار قوی تر از فلوروفورهای معدنی است و به خاطر نشر و درخشندگی زیادی که دارند کاندیدای خوبی برای آنالیزهای حساس به شمار می روند؛ به طوری که نیاز به آمپلی فیکاسیون قبلی نمونه را بر طرف می کنند. نانوذرات سیلیکا علاوه برآنالیزهای حساس، در تصویرسازی مولکولی و تشخیص همزمان چندین مولکول هدف با استفاده از مولکول های رنگی با اندازه های مختلف (و در نتیجه رنگ های مختلف) کاربرد دارند. پایداری و چگالی بالای سیلیکا ، جداسازی سانتریفوژی، تغییرات سطحی و دیگر فرایندهای آنالیز را راحت تر کرده است. از مزایای دیگر این ذرات، هیدروفوبیک بودن ساختمان آنهاست که باعث محافظت از حمله های میکروبی، تورم و یا تغییر منافذ آنها در اثر تغییر pH می شود[۱۶]. از خاصیت فلورسنتی بالای نانوسیلیکا برای تشخیص میکروارگانیسم ها و همچنین DNA و پروتئین در زمان سریع با حساسیت بالا استفاده می گردد[۱۶و۱۷]. این ذرات به دلیل داشتن مولکول های رنگی بیشتر در داخل ماتریکس سیلیکا، سیگنال هیبرید خیلی قوی نسبت به نانوذرات قبلی مورد اشاره شده ایجاد می کنند[۱۶].
با استفاده از انواع مختلف رنگ های داخل ماتریکس که دارای غلظت های مختلف هستند، می توان نانوذرات بارکدینگ Substrate) Barcoding) ایجاد کرد که مشخصات نوری ویژه ای دارند، این نانوذرات قادر به شناسایی همزمان چندین مولکول زیستی را روی سطح سلول هدف هستند. [۱۶].
نانوذرات و آنتی بادی که با نسبت های مختلفی که دارند، به طور ویژه میکروسفرهای پوشیده با آنتی بادی ثانویه مربوطه را تشخیص می دهند، در نتیجه به طور همزمان فرایندهای تشخیص بین نانوذرات گنژوگه و مولکول های هدف مربوطه روی سطح سلول انجام می شود. وقتی که مخلوط نانوذرات سلول از یک فلوسایتومتر عبور داده می شود هر کمپلکس نانوذرات سلول فلورسانس ویژه ای را ایجاد می کند که مشخصه نانوذرات متصل شده و در نتیجه نمونه به خصوصی در ایجاد یک موجی ویژه محسوب می شود. از نانوذرات سیلیکا به دلیل داشتن خاصیت احیاکنندگی زیادشان به عنوان نشان های الکتروشیمیایی نیز استفاده می شود.
نتیجه گیری
۱) ذرات نانو به عنوان Labels یا Tags، حساسیت، سرعت و انعطاف پذیری تست های بیولوژیکی که حضور یا فعالیت مواد مورد نظر را اندازه می گیرند افزایش می دهد.
۲) نانوذرات قادر به آزمایش نمونه های در حجم کم هستند.
۳) از بسیاری از روش های توصیف شده می توان برای DNA و پروتئین ها استفاده کرد.
۴) نانوذرات امکان تشخیص میکروارگانیسم ها یا مولکول هایی که به وسیله روش های رایج امکان پذیر نیست فراهم می سازند.
۵) تشخیص اولیه بیماری هایی از قبیل سرطان، بهبود و موفقیت درمان را بیشتر می کند.
۶) برخی از روش های اشاره شده نیاز نمونه به PCR را برطرف می کنند.
۷) نانوذرات با کاهش زمان مورد نیاز برای تست نمونه یک اثر مثبت روی تصمیم گیری های بالینی و هزینه های درمان دارند.
۸) پروب های نانوذرات امکان کاربری در تشخیص های in vivo را به خوبی دارا هستند.
۹) اکثر این ترکیبات غیر سمی یا سمیتشان خیلی پایین است.
منابع
۱-Natalia, C. T. and Zhiqiang, G. (۲۰۰۶) Nanoparticles in biomolecular detection Nanotoday ; ۱ (۱) : ۲۸-۳۷
۲-Salata, O. V. (۲۰۰۴) Application of nanoparticles in biology and medicine J. Nanobiotechnology; ۲ (۳) : ۱-۸
۳-Kewal, K. and Jain, T. (۲۰۰۵) Nanotechnology in clinical laboratory diagnostics Clinica Chimica Acta; ۳۵۸: ۳۷۵۴
۴-Paolo, F. , Larry, J. and Saul, S. (۲۰۰۵) Nanobiotechnology: the promise and reality of new approaches to molecular recognition Trends in biotechnology ; ۲۳ (۴) : ۱۶۹-۱۷۳
۵- Shad, C. and Mirkin, C. A. (۲۰۰۵) DNA-Gold-Nanoparticles Conjugates In: Nanobiotechnology: Concepts,Application and perspectives. (Niemeyer, C. M. and Mirkin, C. A.) ,WILEY-VCH. pp. ۲۸۹-۳۰۷
۶- Shad, T. C. , Dimitra, G. and Mirkin, C. A. (۲۰۰۵) Gold nanoparticle probes for the detection of nucleic acid targets Clinica Chimica Acta. xx (۲۰۰۵) xxx xxx
۷-Jwa, M. N. , Shad, C. and Chad, C. M. (۲۰۰۳) Nanoparticle-Based Bio-barcodes for the Ultrasensitive Detecetion of proteins Science ; ۳۰۱: ۱۸۸۴-۱۸۸۶
۸- Jwa, M. N. , Savka. I. S. and Chad A. M (۲۰۰۴) Bio-Bar-Code-Based DNA Detection with PCR-like Sensitivity J. Am. Chem. Soc ; ۱۲۶ (۱۹) : ۵۹۳۲ -۳
۹-Park,S. J. and Chad, C. M. (۲۰۰۲) Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle probes Science ; ۲۹۵: ۱۵۰۳۱۵۰۶
۱۰- Xiaohu, G. , Yang, L. , John A P. and Marshall, F. (۲۰۰۵) In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots Current |Opinion in Biotechnology ;۱۶: ۶۳-۷۲
۱۱- Xiaoho,G. and Shuming,N. (۲۰۰۵) Luminescent Quantum Dots for biological Labeling In: Nanobiotechnology: Concepts,Application and perspectives. (Niemeyer, C. M. and Mirkin, C. A.) , WILEY-VCH. pp. ۳۴۳-۳۴۱
۱۲-Wu X, L. H. , and Liu, J. (۲۰۰۳) Immunofluorescent labeling of
cancer marker Her۲ and other cellular targets with semiconductor
quantum dots Nat. Biotechnol. ;۲۱: ۴۱ ۶.
۱۳-Pedro,T. , Maria, D. and Morale, P. (۲۰۰۳) The preparation of magnetic nanoparticles for application in biomedicine J. Phys. Appl. Phys;۳۶: R۱۸۲-R۱۹۷
۱۴- Conte,L. , Nitin ,N. and Gang, B. (۲۰۰۵) Magnetic nanoparticle probes Nanotoday ;may ۲۰۰۵: ۳۲-۳۸
۱۵-E. Romanus, M. , Hückel, C. and Weitschies, R. (۲۰۰۳) Magnetic nanoparticle relaxation measurement as a binding specific technique for in vivo diagnostics file: //F: \\nnn\\Nanoparticle Symposium May ۲۰۰۳- Abstracts.
۱۶- Wang,L. , Kemin, W. , Swadeshmukul, S. ,Xiaojun, Z. Yanrong, W. (۲۰۰۶) Watching Silica Nanoparticles Anal. Chem ;February ۱: ۶۴۶-۶۵۴
۱۷- Zhao, X. , Lisa R. Hilliard*, Mechery,S. J. , Wang ,Y. ,Rahul, P. and Jin, Sh. (۲۰۰۴) A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation
using bioconjugated nanoparticles PNAS;۱۰۱ (۴۲) : ۱۵۰۲۷-۱۵۰۳۲etic
