بارکدینگ دی ان ای (DNA Barcoding)

خط شناسه گذاری( DNA (DNA barcoding عبارت است از استفاده از یک توالی کوتاه از یک منطقه استاندارد ژنوم جهت کمک به تشخیص، تمایز گونه‌ها و تخصیص دادن نمونه‌ها به گونه‌های شناخته شده یا جدید. این یک حوضه علمی کاملاً جدید در زمینه مطالعات تاکسونومی، سیستماتیک و تنوع زیستی موجودات مختلف می‌باشد. این علم جدید دارای اهمیت معنی‌داری در طبقه‌بندی سریع، دقیق و مطمئن گونه‌های متنوع موجودات زنده و مهم از نظر اقتصادی، پزشکی وکشاورزی می‌باشد.  

مفهوم شناساگر مولکولی یا DNA Barcoding اولین بار در سال 2003 توسط هبرت و گروه تحقیقاتی اش از دانشگاه گولف وارد عرصه جامعه علمی گردید. هبرت در مقاله خود تحت عنوان شناسایی زیست شناختی با استفاده از شناساگر مولکولی DNA Barcoding (Biological identifications through DNA barcodes) سیستمی نوین را برای شناخت و شناسایی گونه ها با استفاده از بخش کوچکی از DNA به عنوان بخش استاندارد ژنوم تعریف می کند.

توالی  DNA در این روش می تواند در شناسایی گونه های مختلف به همان طریقی عمل کند که نوارهای بارکد  UPC درفروشگاهها به شناسایی کالاهای مصرفی کمک می کنند.

ناحیه ژنی که برای شناسایی مورد استفاده قرار می گیرد ناحیه 648 نوکلئوتیدی در ژن سیتو کروم اکسیداز (Co1) میتوکندری می باشد که در سالهای گذشته نشان داده است در شناسایی پرندگان، پروانه ها، ماهیان، حشرات ، انگلها و پارازیتها بسیار موثر بوده است. مزیت عمده استفاده از Co1 آن است که علی رغم کوتاهی این بخش از ژن میتوکندریایی و تعیین توالی سریع و ارزان آن، اطلاعات کافی را برای شناسایی و جدایی گونه های نزدیک فراهم می آورد.

اگرچه Co1 در شناسایی گروهای گیاهی کاربرد زیادی نداشته است چراکه سرعت موتاسیون کند تری را نشان می دهد، اما دو ژن matK وrbcL. کلروپلاست به عنوان ژنهای کاندید برای بارکد گیاهان معرفی شده اند.

شناسایی فرایند شناساگر مولکولی یا DNA Barcoding

شناسایی گونه ها بر اساس شناساگر مولکولی از نمونه گیری آغاز می شود. این نمونه ها از منابع مختلفی تآمین می شود که در آنجا موضوع شناسایی به عنوان پرسش اصلی مطرح می شود. نمونه های مورد سوال می تواند شامل نمونه های بافت خون،عظله، پر، مو و یا هر بافت مشکوک مورد سوال باشد. حتی نمونه های مورد سوال میتواند از نمونه های موزه ای تاریخ طبیعی و یا هرباریوم ها با قدمت زیاد گرفته شده باشد. در مرحله آزمایشگاهی، تکنسین های آزمایشگاهی با استفاده از بخش کوچکی از این بافت ها، DNA را استخراج نموده و پس از جداسازی بخش بارکد و تکثیر آن در طی مرحله PCR.نهایتآ تعیین توالی می گردد.

تعیین توالی شامل مجموعه ای از نوکلئوتید های آدنین (A)، گوانین (G)، سیتوزین(C)، و تیمین (T) می باشد که تصویرنوار بارکد آنها به صورت زیر خواهد بود.

CCTATACCTAATCTTCGGAGCATGAGCGGGCATGGTAGGC



پس از تهیه بارکد اطلاعات می تواند در بانک های اطلاعاتی ذخیره و به عنوان کتابخانه مرجع برای شناسایی گونه های مجهول مورد استفاده قرار گیرد.

 

یکی از دشواری هایی که زیست شناسان هنگام کار روی موجودات زنده با آن دست به گریبان اند، شناسایی گونه است. تعیین گونه حتی برای زیست شناسن خبره و کارکشته هم آسان نیست، روندی طولانی دارد و به علاوه، چون معمولاً حد ومرز گونه مبهم و نامشخص است، معلوم نیست که واقعا اعضای گونه مورد مطالعه خود همه به یک گونه تعلق دارند یا از چند گونه نزدیک به هم یا به اصطلاح از چند گونه پنهان تشکیل شده اند مانند پروانه جهنده که در شمال غربی کاستاریکا زندگی می کند و گرچه همه اعضای آن یک نام علمی دارند و یک گونه به شمار می روند اما در واقع شامل 3 تا 10 گونه پنهان است.

شناسایی و رده بندی گونه ها از زمان کارل لینه در حدود 250 سال پیش تا سال های اخیر بدون تغییر و بیشتر با استفاده از صفات و ویژگی های ظاهری مانند رنگ، شکل و رفتار موجودات زنده انجام می شد. اما چند دهه است که پیشرفتی در این فن روی داده و به تازگی از اطلاعات مولکولی و ژنتیک و رده بندی گونه ها استفاده می کنند، اگر چه روش های کلاسیک و جدید برای دستیابی به اطلاعات ژنتیک بسیار وقت گیر است. حدود 30 سال پیش کارلوس با استفاده از تنوع توالی های RNA ریبوزومی(rRNA) فرمانرو آرکی ها را از پروکاریوت ها جدا و ساختار درخت زندگی را اصلاح کرد. او نشانگر های مولکولی مانند آلوزایم ها،rRNA و mtDNAvage را عملا به سیستماتیک مولکولی وارد کرد.

چند سال پیش، یکی از زیست شناسان که از روند نامناسب شناسایی و رده بندی موجودات به تنگ آمده بود و به دنبال روشی آسان تر برای سر و سامان دادن به موجودات زنده پر شمار و رو به فزونی و راهی برای خلاصی از این وضعیت می گشت، در فروشگاهی مشغول خرید بود. او مشاهده کرد که کارکنان فروشگاه می توانند در یک چشم به هم زدن و فقط با استفاده از مجموعه هایی از خطوط نازک و ضخیم که روی بر چسب هایی به اجناس فروشگاه نصب شده اند و بارکد(خط شناسه) نامیده می شوند، به اطلاعات بسیاری در مورد هر کالا دست یابند. او شگفت زده با خود اندیشید: "چرا ما زیست شناسان از این نوآوری استفاده نکنیم و با کاربرد چهار نوکلئوتید مختلف موجود در DNA برای خیل عظیم موجودات زنده کره زمین بر چسب تهیه نکنیم ؟"

اما کار به آسانی آنچه در ابتدا تصور می رفت، نبود، باید قطعه کوچکی از DNA را یافت که در همه موجودات زنده وجود داشته باشد و در عین حال خاص هر گونه باشد، یعنی در گونه های مختلف متفاوت باشد، به نحوی که با کمک آن بتوان همه گونه ها را از هم تفکیک کرد و تشخیص داد. هدف آن بود که هر کس که به شناسایی موجودی زنده نیاز دارد، از دانشجویی که برای نمونه های زنده به نوک کوه رفته است تا پژوهشگری که در آزمایشگاه در حال مطالعه موجودی زنده است، باید بتوانند با قرار دادن ذره ای اندک از بافت هایی مانند موی پستاندار یا پای حشره در زیر دستگاه بارکدخوان، با اطمینان آن را شناسایی کند و به علاوه، اطلاعات موجود درباره آن را بدست آورد. مانند کاری که در فروشگاه ها با برچسب های بارکد دار می شود. در این صورت هرکس در هر جا خواهد توانست هر گونه ای را که می خواهد شناسایی کند. با این روش می توان نه فقط درباره 7/1 میلیون گونه ای که شناسایی شده اند، بلکه برای میلیون ها گونه که هنوز ناشناخته مانده اند و پنهان از چشم ما در حال زنگی بر کره خاکی اند، به طور نامحدود بارکد تهیه کرد. برآورده شدن این آرزو نخستین کار پیدا کردن قطعه ای DNA بود  که به اندازه کافی بلند باشد که بتواند خصوصیات هر گونه را متمایز کند و در عین حال به اندازه ای کوتاه باشد که کار کردن با آن حتی الامکان آسان باشد.

پس از مدتی کوشش و خطا، قطعه ای از یک ژن مییتوکندریایی برای این کار در جانوران شناسایی و به عنوان نشانگری استاندارد معرفی شد. DNA میتوکندریایی به این علت برای این کار مناسب است که تفاوت توالی ان در گونه های مختلف بیشتر از DNA هسته ای است. به علاوه، DNA میتوکندریایی فراوان تر از DNA هسته ای است و بنابراین، آسان تر به دست می آید، به ویژه از نمونه های کوچک یا تجزیه شده. این ژن استاندارد باعث فعالیت زیرواحد 1 آنزیم سیتوکروم C اکسیداز، یا به اختصار CO1 می شود. منطقه ای از این ژن که برای تعیین بارکد در نظر گرفته شد، به اندازه ای کوتاه است که توالی جفت بازهای نوکلئیک اسیدهای آن را می توان با یک بار خواندن با دستگاه بارکدخوان رمزگشایی کرد. این منطقه  بسیار کوچک در همه سلول ها وجود دارد و در گونه های مختلف به اندازه ای متنوع است که می تواند گونه را تشخیص دهد. بارکد CO1 فقط 648 جفت باز درازا دارد. پژوهشگران برای آن که این برچسب کوچک DNA را بیازمایند، و به قابلیت آن برای تفکیک گونه ها مطمئن شوند، بارکدهایCO1 را از گروه های مختلف جانوری، از خشکی و دریا، از قطب ها تا استوا آزمودند و به این نتیجه رسیدند که بارکدCO1 به تنهایی طرفیت دارد تا در حدود 98 درصد از گونه های جانوری را در تاکسون های مختلف شناسایی کند. در سال 2009 پیشنهاد شد که چون تنوع ژن سیتوکروم C اکسیداز در گیاهان نسبت به جانوران بسیار اندک است، برای گیاهان از دو ژن کلروپلاستی rbcL و matK استفاده شود.

دومین قدم پس از تعیین بارکد، ایجاد کتابخانه ای از این قطعه ها به عنوان مرجع بود که هویت گونه های موجود در آن قبلا تایید شده باشند. روش ایجاد کتابخانه بسیار ساده بود: هرکس که نمونه DNA را از نمونه ای از بافت به دست آورده است، توالی جفت بازهای بارکد را شناسایی و اطلاعات را به پایگاه داده ها با عنوان "سیستم بارکد داده های حیاتی" یا BOLD برقرار شده است. در این پایگاه تا کنون (مهرماه1390)، 1372896 ورودی از بیش از 113606 گونه جانوری با مدخل های فشرده از پرندگان، ماهی ها و پروانه ها وجود دارد. هر یک از این مدخل ها شامل نام گونه، توالی بارکد، محل جمع آوری نمونه، پیوند به نمونه مستند، عکس و دیگر داده های زیستی است. کنسرسیوم بارکد زندگی در سال 2005 تاسیس شده تا با هماهنگی مجموعه کوشش ها به گسترش این کتابخانه تراکمی کمک کند. این پروژه قرار است تا امسال(2012) تعداد پنج میلیون نمونه را از 500000 گونه بارکد کند.

بارکد جانداران کاربردهای مختلف دارد. مثلا: شناسایی گونه گیاه فقط با استفاده از ذره ای برگ، ساقه یا بخش های دیگر، بی نیاز از گل یا میوه، شناسایی لارو حشرات که نسبت به حشرات بالغ ئیژگی افتراقی اندکی دارند، شناسایی رژیم غذایی جانوران با بررسی محتویات روده آن ها، شناسایی محصولات تجاری، مانند مکمل های غذایی، داروهای گیاهی و غیرع، سرعت بخشیدن به مطالعات تنوع زیستی و شناخت هرچه سریع تر میلیون ها گونه ناشناخته، شناسایی پشه های ناقل بیماری های عفونی، تشخیص نوع گوشت در رستوران ها، تشخیص نوع آفت های کشاورزی و باغداری، تشخیص بیماری های قارچی و ناشی از تک سلول ها، مانند مالاریا، شناسایی نمونه هایی که در کشورهای موزه ها در انتظار شناسایی اند، اطمینان از نوع تغذیه دام ها. بارکد ها را می توان نقشه هایی از تنوعDNA دانست که هارچوب هایی برای مطالعه آینده اند. همانطور که سرعت و هزینه عکس برداری هوایی سبب شده است که جای بررسی های زمینی رابگیرد، بارکد DNA نیز می تواند نخستین گام سریع و ارزان در کشف گونه ها باشد. گرچه این کار به زمان نیاز دارد، این رویکرد دیدگاهی یکپارچه از زندگی در گذشته و امروز به دست می دهد و عظمت زندگی را به طور کامل به قرن های آینده جاری می کند.