نگاهى به مهندسى تولید متابولیت هاى ثانویه

بعضى از موجودات زنده خصوصاً گیاهان، طیف وسیعى از ترکیبات موسوم به متابولیت هاى ثانویه را تولید مى کنند. در مفهوم کلى، متابولیت هاى ثانویه ترکیباتى آلى هستند که نقش ضرورى در رشد و نمو موجود زنده ندارند. گیاهان براى بیوسنتز این مواد انرژى زیادى را به کار مى برند. زمانى که این ترکیبات اثرى بر رشد و تمایز گیاه نداشته باشند، قاعدتاً باید منافع دیگرى داشته باشند. مطالعه در زمینه وظایف این ترکیبات در گیاهان، یک موضوع جذاب و مهم براى بسیارى از پروژه هاى تحقیقاتى شده است و نقش اکولوژیکى تعدادى از این ترکیبات مورد بررسى و تحقیق قرار گرفته است.   

  با مطالعاتى که تاکنون صورت گرفته است، به نظر مى رسد که متابولیت هاى ثانویه، به عنوان موادى طبیعى، نقش اکولوژیکى مهمى در واکنش هاى دفاعى گیاهان و همچنین گرده افشانى و انتشار دانه هاى گیاهان به وسیله حشرات و حیوانات دارند. بعضى از این ترکیبات به عنوان علف کش و حشره کش در صنعت استفاده مى شوند در حالى که برخى دیگر کاربرد صنعتى ندارند. دسته بزرگى از متابولیت هاى ثانویه کاربرد دارویى و پزشکى دارند. ترکیبات دیگرى از این گروه نیز نقش مهمى در تغذیه انسان و دام دارند.

  تفاوت هاى متابولیت هاى ثانویه با متابولیت هاى اولیه

سلول ها خصوصاً سلول هاى گیاهى دو دسته از ترکیبات را تولید مى کنند؛ متابولیت هاى اولیه و متابولیت هاى ثانویه.

 متابولیت هاى اولیه

متابولیت هاى اولیه مستقیماً در رشد و متابولیسم درگیر هستند و شامل کربوهیدرات ها، لیپیدها، پروتئین ها و اسیدهاى نوکلئیک مى شوند. در گیاهان متابولیت هاى اولیه طى فرایند فتوسنتز تولید شده و سپس در ساخت ترکیبات سلول نقش آفرینى مى کنند. این ترکیبات در حجم زیاد و با ارزش اقتصادى پائین تولید مى شوند و عمدتاً به عنوان ماده خام صنعت، موادغذایى و افزودنى ها کاربرد دارند. روغن هاى گیاهى، اسیدهاى چرب (براى ساخت صابون و شوینده ها) و کربوهیدرات هایى مانند ساکاروز، نشاسته، پکتین و سلولز مثال هایى از متابولیت هاى اولیه هستند. قیمت این قبیل ترکیبات به طور میانگین دو دلار در هر کیلو بوده و تولید آنها در حجم انبوه امکان پذیر است. البته برخى از متابولیت هاى اولیه مانند میواینوزیتول و بتاکاروتن گران هستند که علت قیمت بالاى آنها، سختى استخراج و تخلیص آنها است.

  متابولیت هاى ثانویه

متابولیت هاى ثانویه از بیوسنتز متابولیت هاى اولیه به دست مى آیند و به عنوان ترکیبات فرعى و انتهایى متابولیسم اولیه در نظر گرفته مى شوند. همچنین این ترکیبات در فرآیندهاى متابولیسمى وارد نمى شوند. مهمترین متابولیت هاى ثانویه آلکالوئیدها، فنولیک ها، روغن هاى ضرورى، استروئیدها، لیگنین ها، تانن ها و فلاوونوئیدها هستند. متابولیت هاى ثانویه عمدتاً در گونه ها و خانواده هاى خاصى از سلسله گیاهان تولید مى شوند. این ترکیبات به مقدار کمى در سلول ذخیره شده و عمدتاً در سلول هاى تخصصى و در مرحله خاصى از چرخه زندگى گیاه تولید مى شوند و همین امر استخراج و تخلیص آنها را در مقایسه با متابولیت هاى اولیه که در تمام سلول ها تولید مى شوند، دشوار مى کند. گیاهان دارویى از لحاظ میزان متابولیت هاى ثانویه بسیار غنى هستند و ترکیبات آنها را در انگلیسى Medicinal یا Officinal مى نامند. این ترکیبات که از گروه متابولیت هاى ثانویه هستند، اثرات فیزیولوژیکى عمیقى بر پستانداران دارند و از مهمترین ترکیبات دارویى هستند. از این گیاهان و اثرات فیزیولوژیک ترکیبات موثره آنها به عنوان داروى خوراکى استفاده شده و در نتیجه این ترکیبات، داروهاى گیاهى یا داروهاى طبیعى نام گرفته اند. استفاده از داروهاى با منشاء گیاهى بدون انجام فرآورى خاصى، یعنى استفاده از پودر گیاه یا مواد موثره آن بدون خالص سازى عصاره گیاهى، از قدیم رواج داشته و حتى در حال حاضر و در پزشکى مدرن از طیف وسیعى از داروهاى با منشاء گیاهى استفاده مى شود. گرچه تعدادى از این داروها به طور مصنوعى براى مصارف ساخته مى شوند ولى هنوز بسیارى از آنها از منابع طبیعى به دست مى آیند. به محض اینکه اثر فیزیولوژیک یک گیاه دارویى خاص کشف شود، تلاش ها براى یافتن خصوصیات دقیق شیمیایى ماده موثره آن (داروى گیاهى) و در پى آن، یافتن روش تولید شیمیایى این ترکیبات به طور تجارتى صورت مى گیرد. براى تعیین خصوصیات شیمیایى و شناسایى یک متابولیت ثانویه، جداسازى آن به صورت کاملاً خالص الزامى و اولین قدم است. روش هاى جداسازى گوناگون و مراحل آن اکثراً طولانى است. متابولیت هاى ثانویه به صورت خالص و با نسبت هاى مشخص در پزشکى استفاده مى شوند. البته در کنار خالص سازى مواد موثره گیاهان دارویى، آنها بدون تغییر نیز در سامانه هاى مختلف تهیه دارو استفاده مى شوند. این نکته را نباید فراموش کرد که در کنار متابولیت هاى ثانویه، تعدادى از متابولیت هاى اولیه نیز اثرات فیزیولوژیکى قوى دارند. اکثر این ترکیبات پروتئینى بوده و عملکردهاى مختلفى دارند. هورمون ها و زهرمارها مثال هایى از پروتئین هاى با اثرات فیزیولوژیکى قوى هستند. آنتى بیوتیک ها، واکسن ها و تعدادى از پلى ساکاریدها که نقش هورمونى دارند، از جمله متابولیت هاى اولیه با اثر فیزیولوژیکى قابل ملاحظه هستند.
 مسیرهاى تولید متابولیت هاى ثانویه

اسکلت کربنى متابولیت هاى ثانویه از کربوهیدرات ها تامین شده و طى فرآیند فتوسنتز ایجاد مى شود. متابولیت هاى اولیه دیگرى که در تولید متابولیت هاى ثانویه نقش دارند، اسیدهاى آمینه هستند. استیل کوآنزیم و اسید مِوالونیک نیز نقش مهمى در تولید انواع ترپنوئیدها دارند. مسیر اسید شیکیمیک نیز در تولید لیگنین ها و ایندول آلکالوئیدها نقش آفرینى مى کند.

• مهندسى تولید متابولیت هاى ثانویه در گیاهان
در حال حاضر دستاوردهاى زیاد و گوناگونى در مهندسى متابولیک متابولیت هاى ثانویه به دست آمده است. مسیرهاى بیوشیمیایى مختلفى با استفاده از ژن هاى رمزکننده آنزیم هاى مهندسى شده و پروتئین هاى تنظیمى بررسى شده اند. در عین حال از ژن هاى آنتى سنس نیز براى مسدود کردن مسیرهاى بیوشیمیایى و افزایش تولید متابولیت ثانویه خاصى استفاده مى شود. متابولیت هاى ثانویه وظایف مختلفى در طول چرخه زندگى گیاه دارند. از جمله این وظایف انجام نقش ترکیبات واسطه در برهم کنش گیاه و محیط اطرافش و برهم کنش گیاه با حشرات، ریزسازواره ها و حتى گیاهان اطراف است. تولید متابولیت هاى ثانویه همچنین ممکن است بخشى از سامانه دفاعى گیاه باشد. این ترکیبات در تولیدمثل گیاه نیز نقش دارند که از طریق جذب حشرات گرده افشان این کار را انجام مى دهند. متابولیت هاى ثانویه گیاهى نقش مهمى در ایجاد کیفیت مواد غذایى (رنگ، طعم و بو) مختلف دارند. همچنین رنگ گیاهان زینتى و گلبرگ گل ها که مهمترین خاصیت این دسته از گیاهان است، توسط متابولیت هاى ثانویه ایجاد مى شود. بسیارى از متابولیت هاى ثانویه نیز براى تولید دارو، رنگ، حشره کش ها، طعم دهنده هاى غذایى و عطر استفاده مى شوند. به دلیل کاربردهاى فراوان، متابولیت هاى ثانویه موضوع جالبى براى تحقیقات اصلاح نباتات از طریق فنون مولکولى و مهندسى ژنتیک محسوب مى شوند. در ده سال گذشته تحقیقات چندانى در ارتباط با متابولیت هاى ثانویه انجام نشده است. مانع بزرگ در انجام این تحقیقات اطلاعات اندک از مسیرهاى تولید زیستى متابولیت هاى ثانویه و برهم کنش آنزیم هاى درگیر در این مسیر است. همچنین تعداد معدودى از ژن هاى مربوط به متابولیت هاى ثانویه در دسترس است. یکى از مسیرهایى که مطالعات بیشترى در سطح ژن هاى دست اندرکار آن نسبت به دیگر متابولیت هاى ثانویه انجام شده است، مسیر تولید فلاوونوئیدها و آنتوسیانین ها است. اکثر ژن هاى درگیر در مسیر تولید آنتوسیانین ها همسانه سازى شده و مطالعات فراوانى در سطح بیوشیمیایى، مولکولى و ژنتیک این دست از متابولیت هاى ثانویه صورت گرفته است. یکى از مهمترین دلایل مطالعات بیشتر در این زمینه، آسانى بررسى این مواد از روى رنگ گل ها به فنوتیپ قابل غربال گرى است. دیگر مسیر تولید متابولیت هاى ثانویه که در سطح آنزیم هاى درگیر و مواد واسط مورد مطالعه قرار گرفته است و اهمیت زیادى در داروسازى دارند، ایندول آلکالوئیدها هستند. اما در این مسیر هم ژن هاى محدودى مشخص شده اند. هدف از مهندسى ژنتیک مسیر یک متابولیت ثانویه، افزایش مقدار یک ماده خاص یا گروهى از ترکیبات و یا حتى کاهش مقدار این ترکیبات است. براى دستیابى به هدف دوم که کاهش میزان تولید یک ماده خاص یا گروهى از مواد ناخواسته است، راه هاى مختلفى وجود دارد. [این مواد ممکن است ترکیبات سمى در یک محصول گیاهى، مواد مانع خالص سازى یک فرآورده صنعتى یا موادى از این دست باشد.] یکى از این راه ها، مسدود کردن یک مرحله از مسیر تولید متابولیت ثانویه و مختل کردن تولید یا فعالیت آنزیم مربوط به آن مرحله است. این هدف مى تواند با کاهش میزان mRNA مسئول تولید این آنزیم، با استفاده از فناورى آنتى سنس، RNAi یا بیان بالاى یک آنتى بادى علیه آنزیم مسئول محقق شود. فناورى آنتى سنس به خوبى براى تغییر رنگ گل ها استفاده شده است. راه هاى دیگر دستیابى به این هدف، تغییر مسیر به سوى مسیرهاى موازى یا افزایش کاتابولیسم ماده نهایى است. اما ممکن است هدف از انجام تحقیقات، افزایش تولید یک ترکیب خاص در گیاه بوده یا انتقال ژن هاى مربوط به مسیر تولید یک متابولیت ثانویه به یک گیاه یا یک ریزسازواره مورد نظر باشد. همچنین ممکن است تولید یک ماده جدید که به صورت طبیعى در گیاهان تولید نشود هدف یک پروژه تولیدى- پژوهشى باشد. در برخى روش ها با تغییر میزان بیان یک یا چند ژن، بر موانع تولید یک ماده غلبه مى کنند و در روش هاى دیگر، با حذف مسیرهاى موازى (رقابتى) یا کاهش کاتابولیسم ماده مورد نظر، مقدار آن ماده را در گیاه مى افزایند. ایجاد تغییراتى در بیان ژن هاى تنظیمى که کنترل مسیر تولید زیستى متابولیت هاى ثانویه را برعهده دارند نیز از جمله روش هاى افزایش یا کاهش تولید ترکیب مورد نظر است. در ادامه این مطلب برخى از نتایج به دست آمده از بررسى نحوه تولید متابولیت هاى ثانویه ژن هاى مسئول و تنظیم بیان ژن هاى درگیر ارائه مى شود.

 فلاوونوئید ها و آنتوسیانین ها

ـ ژن هاى مسئول بیوسنتز فلاوونوئید ها و آنتوسیانین ها

بیوسنتز فلاوونوئید و آنتوسیانین از اولین مسیر هاى متابولیت هاى ثانویه بود که مهندسى ژنتیک آنها صورت گرفت. دلیل این موضوع این بود که مسیر بیوسنتز آنها به خوبى شناخته شده بود و نتایج تغییرات انجام شده به راحتى از روى تغییر رنگ گل ها قابل مشاهده است.
آزمایش هاى زیادى شامل افزایش بیان ژن هاى مختلف براى ایجاد رنگ هاى جدید گل یا تولید ترکیبات جدید در گیاه انجام شده است.

به خاطر خواص آنتى اکسیدانى این ترکیبات افزایش میزان تولید و مقدار آنها در غذا هاى گیاهى موضوع جالب توجهى براى دانشمندان بوده است. اکثر پژوهش هاى انجام شده در زمینه بیوسنتز فلاوونوئید ها و آنتوسیانین ها در گیاه گوجه فرنگى صورت گرفته است. مشخص شده است که آنزیمى از گروه آیزومراز به نام CHI از آنزیم هاى مراحل اولیه مسیر تولید فلاوونوئید نقشى کلیدى در افزایش تولید فلاوونول دارد. افزایش بیان ژن CHI گیاه اطلسى باعث افزایش سطح فلاوونوئید در پوست گوجه فرنگى به میزان ۷۸ برابر مى شود همچنین با تولید گیاهان گوجه فرنگى اصلاح ژنتیکى شده، میزان فلاوونوئید آنها بیش از ۲۰ برابر گیاهان شاهد بوده است. این موضوع حاکى از آن است که افزایش تولید ترکیبات مفید براى سلامتى در محصولات حاصل از گوجه فرنگى امکان پذیر است.
بیوسنتز ایزوفلاوون ها که ترکیباتى ضدمیکروبى هستند، بر اثر آلودگى میکروبى در حبوبات القا مى شود. افزایش بیان ژن ایزوفلاوون سنتتاز که یک آنزیم سیتوکروم P450 است، باعث تولید این ترکیبات در آرابیداپسیس، توتون و ذرت که به طور عادى توانایى تولید این مواد را ندارند، مى شود. تولید این ترکیبات در این گیاهان بستگى به در دسترس بودن پیش ماده هاى مسیر فنیل پروپانوئید دارد. القا یا مهندسى این مسیر مى تواند در اصلاح و بهبود سامانه بیوسنتز ایزوفلاوون در گیاهان میزبان مهم باشد.

ژن هاى تنظیم کننده، تولید فلاوونوئید ها و آنتوسیانین ها

یک روش براى مهندسى بیان ژن هاى یک مسیر بیوشیمیایى استفاده از عوامل رونویسى خاصى است که ژن هاى مسیر هاى بیوشیمیایى متعددى را کنترل مى کنند. در دانه ذرت تولید آنتوسیانین توسط ترکیبى از دو عامل رونویسى R و Cl تنظیم مى شود. پروتئین هاى R شباهت زیادى با پروتئین هایى که توسط ژن هاى مهره داران رمز مى شود (ژن c-MYC) دارد در حالى که پروتئین هاى Cl مشابه محصولات ژن هاى c-MYB است. القاى مسیر تولید فلاوونوئید با افزایش بیان این دو عامل رونویسى R و C1 در سلول هاى تمایز نیافته ذرت در محیط کشت صورت مى گیرد. در برنج افزایش بیان این دو عامل رونویسى مربوط به گیاه ذرت در کنار یک ژن دیگر باعث فعال شدن مسیر بیوسنتز آنتوسیانین و همچنین افزایش مقاومت گیاه برنج به قارچ ها مى شود. در آرابیداپسیس، یک عامل رونویسى از نوع MYB به نام PAP1 تشخیص داده شده است که افزایش بیان آن باعث تولید رنگدانه هاى بنفش پررنگ در زمان نمو گیاه مى شود. این مثال ها نشان مى دهد که مى توان با افزایش بیان یک یا چند عامل رونویسى (حتى با استفاده از ژن هاى بیگانه در گیاه میزبان)، بر این سامانه قدرتمند تنظیمى ژنتیکى در هنگام نمو گیاه، غلبه کرد. عوامل رونویسى گاهى به عنوان مانع ذخیره سازى ترکیبات طبیعى نیز عمل مى کند. غیرفعال سازى ژن عامل رونویسى MYB4 در آرابیداپسیس مى تواند باعث افزایش سطح موادى شود که تحمل گیاه را نسبت به تشعشعات اشعه ماوراءبنفش مى افزایند. افزایش بیان ژن هاى تولیدکننده پروتئین FaMYB1 که از دسته پروتئین هاى MYB است و از گیاه توت فرنگى به توتون منتقل شده است، باعث کاهش تولید رنگدانه هاى گل شده و سطح آنتوسیانین و فلاوونول در گیاه توتون پایین مى آید. تحلیل این اتفاق اینگونه است که FaMYB1 در میوه توت فرنگى به عنوان یک مانع در برخى از مراحل مسیر تولید فلاوونوئید عمل مى کند.

 آلکالوئیدها
 ژن هاى بیوسنتز ایندول آلکالوئیدها

مسیر ترپنوئید ایندول آلکالوئید موضوع بسیارى از تحقیقات مهندسى ژنتیک بوده است چرا که حدود ۱۵ نوع از ترکیبات این مسیر از نظر صنعتى اهمیت دارند که آلکالوئید ضدتومور وینبلاستین از آن جمله است.

همه این آلکالوئیدها در یک قسمت از مسیر بیوشیمیایى تا تولید ماده واسط استریکتوزیدین مشترک هستند و از این نقطه، مسیر در گونه هاى مختلف گیاهى تولیدکننده مواد آلکالوئیدى منشعب مى شود.
بیشتر مطالعات انجام شده براى تهیه نقشه ژنتیکى بخش اولیه و مشترک مسیر و افزودن میزان بیان ژن هاى این بخش از مسیر بوده است. هدف از این کارها افزایش فعالیت مسیر تولید آلکالوئیدها است. به طور مثال، ژن هاى رمزکننده تریپتوفان دِکربوکسیدلاز (TDC) و STR-SS در سلول هاى گیاه Catharnthus roseus به خوبى مورد مطالعه قرار گرفته است. افزایش بیان TDC باعث افزایش ماده حدواسط تریپتامین شده در حالى که به افزایش سطح آلکالوئیدها نمى انجامد اما با حضور STR، افزایش میزان آلکالوئیدها قابل ملاحظه است. با افزودن ماده حدواسط تریپتوفان و ترپنوئیدها به محیط غذایى لاین هاى سلولى مورد آزمایش، آنها ظرفیت تولید میزان بالایى از آلکالوئیدها را تا حدود یک میلى مول در لیتر بروز دادند. این موضوع به این معنى است که شاخه ترپنوئیدى مسیر بیوسنتز متوقف شده است. مطالعات تکمیلى نشان مى دهد که مراحل محدودکننده دیگرى نیز وجود دارند که در اینجا از ذکر آنها خوددارى مى کنیم. TDC و STR در گیاهان دیگرى که مواد آلکالوئیدى تولید نمى کنند نیز بیان مى شود. تغذیه کشت سلولى سلول هاى گیاه توتون با سِکولوگانین، باعث تولید استریکتوزیدین شده اما این ماده که یک گلوکو آلکالوئید است، به جاى ذخیره در واکوئل براى تولید ایندول آلکالوئید در مراحل بعدى (همانند آنچه در Catharnthus roseus اتفاق مى افتد)، به محیط کشت ترشح مى شود. این موضوع اهمیت جنبه هاى فیزیولوژیکى را در تولید زیستى متابولیت هاى ثانویه نشان مى دهد به طورى که نه تنها ژن هاى رمزکننده آنزیم هاى درگیر کاتالیز مراحل تولید زیستى در این امر مشارکت دارند بلکه ژن هاى دیگرى نیز از جمله ژن هاى تنظیم pH و ژن هاى مربوط به انتقال مواد نیز یک پاى قضیه هستند.
          

ژن هاى تنظیم کننده تولید ایندول آلکالوئید

دو عامل رونویسى به نام هاى ORCA2 و ORCA3 که در چندین مرحله از مسیر بیوشیمیایى تولید آلکالوئید در Catharnthus roseus نقش تنظیمى دارند، تعیین شده اند.
افزایش بیان ORCA3 به تنهایى باعث افزایش تولید آلکالوئیدها نمى شود چرا که این عامل رونویسى، ژن G10H را که یک آنزیم سیتوکروم P450 موثر در کاتالیز مرحله اول تولید سکولوگانین است، تنظیم نمى کند. اما پس از تغذیه سلول ها با پیش ماده سکولوگانین که همان لوگانین است، تولید آلکالوئیدها تا میزان ۳ برابر افزایش مى یابد. هر دو این عوامل تنظیمى (ORCA2 و ORCA3) درگیر تولید زیستى ترپنوئید ایندول آلکالوئید بوده گرچه کنترلى بر ژن G10H ندارند. این موضوع نشان مى دهد که ژن هاى دیگرى نیز درگیر تنظیم فعالیت این مسیر هستند که مى تواند موضوع پژوهش هاى بعدى در این زمینه باشد.
نتایج تمامى این مطالعات یک پیام مهم را نیز داشت، براى افزایش بیان یک دسته از آنزیم هاى درگیر در یک مسیر بیوشیمیایى مى توان از ژن هاى تنظیمى استفاده کرد به جاى آنکه بیان هر یک از ژن ها را به طور جداگانه افزایش داد.