بهترین روش استخراج DNA باکتریایی

مراحل استخراج DNA

پس از کشت و وخالص سازی باکتری و انتقال چند لوپ آن به فسفات بافر روش زیر که بهترین و کارامدترین روش استخراج دی ان ای می باشد را انجام می دهیم.  

برای استخراج DNA ما از روش زیر استفاده نمودیم.

1/ابتدا میکروتیوبها را در دور 10000 دور به مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ می کنیم سپس محلول رویی را دور ریختیم

2.به رسوب باکتری 100 میکرولیتر محلول STES افزودیم و به میزان 20 میکرولیتر محلول TE (با pH =7.6) به آ افزودیم به میکروتیوب خود چند ضربه زدیم تا رسوب در محلول حل شود

3.پس از آن 3 میکرولیتر لیزوزیم به وسیله سمپلر پیپتینگ کرده و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه انکوبه کردیم

4.سپس 30 میکرولیتر پروتئیناز K  به میکروتیوب افزودیم و 30 دقیقه در دمای 56 درجه سانیگراد بن ماری قرار دادیم.

5.سپس نصف حجم فنل و نصف هم کلروفرم اضافه نمودیم و به مدت 5 دقیقه در 13000rpm   سانتریفیوژ کردیم.

6.پس از سانتریفیوژ فاز رویی را جدا کرده و به ویال دیگری انتقال دادیم و 0.1 حجم جدا شده استات سدیم و 2.5 برابر حجم جدا شده الکل اتانول مطلق افزودیم. ویال ها را چند بار به آرامی سر و ته میکنیم و بعد ویال ها را به مدت 30 دقیقه در فریزر 20- می گذاریم.

7.پس از آن  ویال ها را از فریزر درآورده و به مدت 5 دقیقه درrpm 13000  سانتریفیوژ کردیم سپس محلول رویی را دور ریخته و 500 میکرولیتر الکل 70 درصد به ویال ها اضافه کردیم.سپس چند ضربه به ویال ها زدیم مجددا به مدت 5 دقیقه در 13000 دور سانتریفیوژ کردیم سپس محلول رویی را دور ریختیم و ویال ها را می گذاریم تا کاملا خشک شود.

8.در آخر به ویال ها به میزان 100 میکرولیتر محلول TE  با pH=8 ریختیم

سپس کیفیت DNA  مستخرج توسط دستگاه نانو دراپ قرائت گردید

منبع: میکروبیولوژی مسجد سلیمان