تولید انسولین نوترکیب

انسولین هورمونی پپتیدی است که توسط سلولهای بتای پانکرانس تولید شده و مستقیما به خون ترشح می شود. ابتدا هورمون به صورت پری پروانسولین توسط ریبوزوم هایی که بر روی شبکه آندوپلاسمی خشن سلولها قرارگرفته ‌اند ساخته می‌شود. این پیش ساز که دارای 23 اسیدآمینه آبگریز به نام قطعه رهبر است به داخل شبکه آندوپلاسمی هدایت می‌شود. درداخل شبکه این قطعه جدا شده و پیشساز به  "پروانسولین" تبدیل می‌شود.   آرایش فضایی این مولکول به صورتی است که شرایط ایجاد پلهای دی‌سولفور را فراهم می‌سازد. در ساختمان پروانسولین، از جهت ریشه آمین انتهایی، ابتدا زنجیرهB قرار گرفته که با یک رشته اسیدآمینه به نام "پپتیدC “ متصل شده و انتهای دیگر پپتیدC با زنجیرهA پیوند یافته است. پروانسولین به داخل دستگاه گلژی منتقل شده تا تحت تاثیر آنزیم های پروتئولیزکننده، مولکولهای انسولین آزاد می‌شوند که پس از تجزیه دو زنجیرهAوB، پپتیدC آزاد می‌شود. دو زنجیرهAوB به وسیله پیوندهای دی‌سولفید به هم متصل می‌شوند و انسولین کامل را به وجود می‌آورند. ساختمان و شکل دانه‌های ترشح کننده انسولین در حین عبور از داخل غشای پلاسمایی تکمیل می‌شود. این هورمون با یون روی ترکیب شده و هگزامرهایی را تشکیل می‌دهند. این دانه‌ها تحت تاثیر تحریکات خاصی با غشای سلول درآمیخته و محتوای خود را به روش اگزوسیتوز به خارج می‌ریزد. ساختار انسولین انسولین هورمون پپتیدی ساده با 51 اسیدآمینه است که حدود 30 اسید امینه در ساختار زنجیره B و 21 اسیدآمینه در ساختمان زنجیرهA بکار رفته است. وزن مولکولی این پروتئین حدود 6000 دالتون است و دارای دو پیوند دی سولفیدی بین زنجیره A, B  است و یک پیوند سولفیدی هم درون زنجیره A وجود دارد. این دو زنجیره به کمک دو پل دی‌سولفید ،یکی بین اسیدهای آمینه شماره 7 از دو زنجیره و دیگری میان اسیدهای آمینه شماره 20 از زنجیرهA و شماره 19 از زنجیرهB با یکدیگر اتصال دارند. علاوه بر این،ریشه‌های اسیدآمینه ردیف 6 و 11 در داخل زنجیرهA، به وسیله پیوند دی‌سولفید به یکدیگر متصل هستند. مکان این پیوندها در گونه‌های مختلف، ثابت است.
جایگاه ژن انسولین در DNA

ژن انسولین روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره 11 قرار گرفته و متشکل از 153 جفت باز می باشد که از این مجموعه باز  63 باز برای کد کردن زنجیره A و 90 باز برای کد کردن زنجیره  B  لازم است. پروتئینی که توسط این بازها کد می شود پری پروانسولین نام دارد که توسط ژنINS  کد می شود.

 تولید انسولین

1-انسولین  تخلیص شده از پانکراس گاو و خوک که از نظر ساختاری با انسولین انسانی مشابهت دارد.

2-انسولین نوترکیب  

معایب استفاده از انسولین حیوانی:

1) به خاطر تفاوتهای جزیی که در ساختمان انسولین حیوانی نسبت به انسولین انسانی وجود داشت در برخی از دریافت کنندگان انسولین منجر به ایجاد واکنش های آلرژیک می شد.  

2)باعث انتقال بیماری از حیوان به انسان می شد. 

3) میزان انسولین  به دست آمده از حیوانات با این روش بسیار کم بود و مقرون به صرفه نبود.

انسولین نوترکیب

اولین تلاشها در 1978 بر روی باکتری اشریشیا کلی توسط هربرت بایر انجام گرفت . وی ژن انسولین انسانی را به ژنوم ا.کولی وارد کرد تا به این طریق انسولین نوترکیب تولید کند. این روش 4 سال بعد توسط سازمان غذا وداروی امریکا مورد تایید قرار گرفت. این روش ، مسیر خوبی برای تولید دارو های مورد نیاز بشر بود که داروها را با کیفیت بهتر از قبل تولید میکرد و بنابراین جایگزین تولیدات قبلی قرار گرفت.

مزایای استفاده از سلول های باکتریایی

1) باکتری ها فیزیولوژی ساده ای داشتند.

2) نرخ رشد و تولید مثل بالایی دارند.

3) بازده تولید محصول در آنها زیاد است به طوری که حدود10 درصد از وزن پیکر آنها را محصولاتشان تشکیل می دهد.

معایب استفاده از سلولهای باکتریایی

1) برخی از پروتئین های نوترکیب فولد صحیحی پیدا نمیکنند ودر نتیجه از نظر زیستی غیر فعال هستند.

2) برخی دیگر از پروتئین های نوترکیب برای باکتری سمی است بنابراین باکتری آن را در غلظت کم تولید می کند تا از سمی شدن محیط زندگی اش جلوگیری کند. برای حل این مشکل باید از پروموتورهای قوی برای  بیان این ژن استفاده کرد.

3) فقدان ساختارهای پس ترجمه نظیر دستگاه گلژی و شبکه آندوپلاسمی باعث می شود که فرآورده تولید شده توسط باکتری ها برای سنتز نهایی نیاز به تیمارهای زیستی و شیمیایی خاصی داشته باشد.  

  دو روش تولید انسولین نوترکیب  

1) سنتز شیمیایی ژن انسولین و درج آن در 2 گروه وکتور و انتقال آن به دو گروه باکتری 

2) تخلیص mRNAحاصل از ژن انسولین و رونویسی معکوس و تولید cDNAو درج  آن در یک گروه وکتور و انتقال آن به یک گروه باکتری

تولید انسولین نوترکیب با روش سنتز شیمیاییDNA

گام اول:  دراین روش ابتدا با دئوکسی ریبونوکلئوتیدها ژن تولید انسولین را سنتز نموده طوری که دو سر آن مطابق با الگوی برش EcoR1 در سمت چپ و1BamH در سمت راست باشد.

گام دوم: برش پلاسمیدpBR322توسط آنزیمهای محدودکننده (EcoR1  و BamH1  )

گام سوم: اتصال ژن سنتز شده در پلاسمید توسط آنزیم لیگازT4

گام چهارم: درج یکی از قطعات زیر قبل از ژن تولید انسولین در وکتور

یک قطعهِDNA اپران لاکتوز شامل اپراتور و پروموتور و 1006 کدون لازم برای سنتز اسیدآمینه بتاگالاکتوزیداز.

یک قطعه DNAاپران تریپتوفان شامل اپراتو و پروموتور و190 کدون لازم برای سنتز تریپتوفان.

درمراحل بعدی ژن رمز کننده اسید آمینه متیونین را برای نشاندار کردن جایگاه برش توسط سیانوژن بروماید بعد ازژن بتاگالاکتوزیداز قرار میدهند.

پس ترتیب قرارگرفتن ژنها در وکتور به این صورت است که ابتدا ژن بتا گالاکتوزیداز قرار میگیرد وپس از آن ژن رمز کننده اسیدآمینه متیونین و درآخر هم ژن سنتز شده برای تولید انسولین

پس ازبیان ژن نوترکیب توسط باکتری ، زنجیره های انسولین به متیونین و بتا گالاکتوزیداز متصل است . این ترکیب باید تحت تیمار سیانوژن برماید قرار میگیرد . سیانوژن برماید از جایگاه متیونین برش میزند و رشته های انسولین را از متیونین و بتاگالاکتوزیداز جدا میکند. حال رشته های انسولین تحت اثر اسید سولفوریک قرار میگیرد تا بنیانهای سولفات به زنجیره های انسولین متصل شود. ودرمرحله آخر محصول درمعرض اکسیژن هوا قرار گرفته و با اکسید شدن بنیان های سولفات ، پلهای دی سولفیدی بین دو زنجیره   A , Bقرار می گیرد و مولکول انسولین کامل میشود. انسولین تولید شده با HPLC از محیط جدا و تخلیص می گردد.

تولید انسولین نوترکیب با cDNA

آماده سازی ژن هدف

برای تولید انسولین نوترکیب با استفاده از cDNA ابتدا باید total RNA  را از سلولهای بتای پانکراس جدا کنیم . با توجه به اینکه mRNA در انتهای3 خود دارای دم polyA میباشد؛ میتوان روی یک ستون oligodt قرار داد و mRNA را از RNA های دیگر جدا کرد ؛ سپس با استفاده از آنزیم ریورس ترانس کریپتاز از روی mRNA ؛cDNA را سنتز کرد .در نتیجه یک هیبرید mRNA –cDNA  به دست می آید .در مرحله بعد mRNA را ازcDNA جدا میکنیم و یک رشته cDNA  به دست می آوریم . برای قرار دادن این cDNA در پلاسمید باید آن را دو رشته ای کرد ؛ پس رشته مکمل این cDNA را هم سنتز می کنیم . cDNA دو رشته ای سنتز شده برای ورود به وکتور مناسب است . به انتهای 5 cDNA یک تری نوکلئوتید AUG که اسیدآمینه متیونین را کد میکند اضافه می کنیم تا محلی را برای برش بتاگالاکتوزیداز از پروانسولین فراهم کند .

آماده سازی وکتور

در این فرایند از وکتور PBR322 استفاده می کنیم که ژن مقاومت به آمپی سیلین در آن وجود دارد . این ژن برای جدا کردن باکتری هایی که وکتور را  دریافت کرده اند از باکتری هایی که وکتور را دریافت نکرده اند ؛ استفاده میشود .باکتری هایی که بتوانند در محیط حاوی آمپی سیلین رشد کنند ؛ باکتری هایی هستند که وکتور را دریافت کرده اند . در وکتور PBR322 ژن بتاگالاکتوزیداز را هم قرار داده ایم ؛ اما فریم خواندن ژن در صورتی صحیح میشود و بتاگالاکتوزیداز فعال را برای ما تولید میکند که ژن هدف وارد وکتور شده باشد . پس اگر باکتری در محیط حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین و X-GAL رشد کند و کلنی های سفید بدهد وکتور موجود در آن باکتری ژن هدف را دریافت نکرده ولی اگر کلنی آبی بدهد وکتور آن ژن هدف را دریافت کرده است .

در مرحله بعد ژن هدف را به وکتور متصل می کنیم (با آنزیم T4ligase ) و باکتری ها را با الکتروپوریشن مستعد می کنیم و وکتورها را وارد آنها می کنیم . باکتری هایی که وکتورحاوی ژن هدف را دریافت کرده اند جداسازی کرده و آنها را کشت می دهیم تا محصول مورد نظر را تولید کنند . محصولی که آنها تولید می کنند پروانسولینی است که با یک آمینواسید متیونین به بتاگالاکتوزیداز متصل شده .با استفاده از CNBr  متیونین را از پروانسولین جدا می کنیم . پروانسولین حاوی c-peptide است که برای تولید انسولین فعال باید با آنزیم cleavage جدا شود . انسولین های فعال تولید شده را با کروماتوگرافی تعویض یونی خالص سازی میکنیم .

منبع: http://biotechnology8668.blogfa.com