آشنایی با تجهیزات و دستگاه های آزمایشگاه مولکولی و کشت بافت گیاهی (2)

برخی تجهیزات و تکنیک های خاص جهت نگهداری کشت های سلولی مورد نیاز است. در واقع داشتن این امکانات بیشتر به معنای انجام هر چه بهتر فرآیند کشت سلول است.  

محیط کار استریل
برای انجام کارهای مربوط به کشت سلول، باید تا جایی که امکان دارد یک اتاق جداگانه در نظر گرفته شود. این اتاق باید عاری از هر گونه شلوغی بوده و در صورت امکان از یک تهویه هوای فیلتر شده در محیط کار برخوردار باشد. یک فیلتر هوایی (High Efficiency Particle Air Filter (HEPA می تواند چنین محیطی را فراهم آورد. بافت اولیه حیوانی و میکروارگانیسم ها نباید در نزدیکی آزمایشگاه کشت سلول کشت شوند و باید یک آزمایشگاه جداگانه و اختصاصی برای کار کشت سلول به صورت استریل طراحی شود. پوشش های مخصوص آزمایشگاه کشت سلول باید در ورودی آزمایشگاه پوشیده شده و لباسی که از این محیط خارج می گردد، نباید مجدداً وارد آزمایشگاه شود. در صورت نیاز به استریلیتی شدید، یک هود لامینار جهت حفظ بهتر از شرایط استریل پیشنهاد می گردد. در صورت استفاده از یک ماده شیمیایی خطرناک باید از هودهای ورتیکال یا عمودی استفاده گردد. به هر حال برای کشت های اولیه و در حالی که هیچ گونه هود لامینار یا اتاق استریل در دسترس نیست، باید یک فضای استریل جهت انجام کار در نظر گرفت. اگر شیوه های سترونی یا استریلیزاسیون به درستی رعایت گردد و نظافت و نظم محیط حفظ شود، می توان تا حدی از محیط کار استریل آسوده خاطر بود.
تمام سطوح کار، میز ها و قفسه ها و هود لامینار باید به طور مرتب با اتانول ۷۰% یا یک پاک کننده جایگزین به درستی پاکیزه و استریل گردند. در صورتی که هود لامینار یا فیلتر های هوا در محیط کار وجود نداشت، کار کشت می تواند بر روی یک میز تمیز با کمک شعله آتش جهت استیل نمودن سطح کار و هوای اطراف آن انجام گردد.

وسایل انکوباسیون
علاوه بر فیلتر های هوا و هود لامینار و میزهای کاری که تمیز کردنشان به راحتی صورت می گیرد، آزمایشگاه کشت سلول به یک انکوباتور برای نگهداری سلول ها در دمای ۳۰ تا ۴۰ درجه سانتیگراد هم نیاز خواهد داشت. دمای انکوباسیون به نوع سلول های کشت شده بستگی دارد. سلول های حشرات در دمای حدود ۳۰ درجه بهترین رشد خود را دارند، در حالی که سلول های پستانداران به دمای حدود ۳۷ درجه سانتیگراد نیاز دارند. استفاده از انکوباتورهایی که برای فراهم کردن CO2 از یک منبع اصلی یا سیلندر گاز استفاده می کنند، ضروری به نظر می رسد، چرا که هوای درون انکوباتور باید همیشه بین ۲ الی ۵% CO2 داشته باشد. به طور کلی، لاین های سلولی بسیاری قادرند در اتمسفری حاوی ۹۵% هوا و ۵% CO2 و با رطوبت نسبی ۹۹% قابلیت زنده ماندن خود را حفظ نمایند. غلظت CO2 باید در تعادل با کربنات سدیم محیط کشت باشد. محیط کشت های مختلف ظرفیت بافری متفاوتی دارند. در صورتی که یک انکوباتور مجهز به CO2 در دسترس نباشد، به طور موقت می توان کشت ها را در یک فلاسک غیر قابل نفوذ حفظ نمود. به این شکل که می بایست پس از گازدهی با CO2 فلاسک ها را به کمک نوار پارافیلم به خوبی مهر و موم نمایید.
همچنین ممکن است محیط کشت های مختلفی مورد استفاده قرار گیرند که نیازی به اتمسفر حاوی CO2 نداشته باشند، که در این حالت به انکوباتور مجهز به CO2 نیازی نیست. برای مثال هپاتوسیت ها در کشت های اولیه خود در محیط کشت Leboviztz L-15  نگهداری می شوند که نیازی به CO2 ندارد، اما در این صورت نباید فلاسک های کشت مهر و موم و نفوذ ناپذیر شوند، چون که هپاتوسیت ها به مقادیر بالای O2 نیاز دارند و با گذشت زمان مقدار اکسیژن در محیط بدون گاز غیر قابل نفوذ کاهش می یابد. بیشتر لاین های سلولی در دمای ۵/۳۶ درجه سانتیگراد نگهداری می شوند، اگر چه برخی کشت ها، از جمله کشت های پوستی ممکن است به دمای پایین تری نیاز داشته باشند. سلول های کشت شده عموماً در دماهای پایین تر زنده می مانند، اما به ندرت دمای زنده ماندن آن ها بیش از ۲ درجه بالاتر از دمای نرمال است و بنابراین انکوباتور باید طوری تنظیم گردد که در دمای تقریباً ۳۸/۵ درجه سانتیگراد افزایش درجه حرارت را جهت جلوگیری از مرگ سلول ها قطع کند. انکوباتور ها طوری طراحی شده اند که یک درجه حرارت یکنواخت را تنظیم کنند، به عبارت دیگر درجه حرارت باید نهایتاً ۵/۰ ± درجه سانتیگراد در هر دمایی که تنظیم شده است تغییر کند. بنابراین انکوباتورهای مجهز به سیستم گردش هوا می تواند به یکنواختی هوا در انکوباتور کمک نموده و آن را حفظ کند.

یخچال و فریزر  (۲۰-)
هر دو این وسایل برای ذخیره محیط کشت مایع در ۴ درجه سانتیگراد و برای آنزیم ها (به طور مثال تریپسین) و برخی دیگر از محتویات محیط کشت (مانند گلوتامین و سرم) در ۲۰- درجه بسیار مهم و ضروری هستند. یخچال برای نگهداری محیط های کشت و بافرها و فریزر برای ذخیره سرم قبل از تقسیم بندی، مواد مغذی و آنتی بادی ها مورد نیاز خواهد بود. این مواد طبیعی برای ذخیره شدن به دمای ۲۰- نیاز دارند، اما سلول ها برای ذخیره و نگهداری به نیتروژن مایع یا فریزر ۷۰- درجه سانتیگراد نیاز دارند.

میکروسکوپ
از آنجا که کشت در فلاسک ها یا پلیت ها انجام می گیرد، یک میکروسکوپ نوری معکوس مورد نیاز خواهد بود. تشخیص تغییرات مورفولوژیکی در هر کشت بسیار حیاتی است، چرا که این می تواند اولین نشانه ایجاد فساد در یک کشت باشد. یک میکروسکوپ نوری بسیار ساده با بزرگنمایی ۱۰۰× برای کار روزمره شمارش سلولی کافی خواهد بود، هر چند میکروسکوپی با کیفیت بهتر برای آنالیز های کروموزومی یا کارهای رادیوگرافی خودکار مورد نیاز می باشد. میکروسکوپ معکوس همچنین برای بررسی فلاسک ها و پلیت های چند خانه از قسمت زیری هر ظرف به کار می رود. هر دو نوع میکروسکوپ باید مجهز به لنز های ۱۰× و ۲۰× بوده و برای میکروسکوپ های معمولی لنز های ۴۰× ۱۰۰× نیز کاربرد دارند. تجهیزات اضافی از جمله دوربین، دوربین ویدئویی CCD، آداپتور و ملزومات دیگر و امکانات UV نیز برای اهداف دیگر مورد نیاز هستند.

ظروف کشت بافت
ظروف یکبار مصرف پلاستیکی جهت انجام کشت انواع مختلفی دارند، اما معمول ترین آن ها ظروفی از جنس پلی استایرن می باشد. اگز چه تمام ظروف پلاستیکی یکبار مصرف برای کشت سلول باید به اندازه کافی رشد سلولی را فراهم آورند، اما حصول اطمینان از اینکه کشت در یک ظرف جدید هم قادر به رشد است یا خیر ضروری به نظر می رسد. آزمایشاتی که در این راستا صورت می گیرند، شامل منحنی های رشد و زمان رسیدن به یک لایه یکنواخت سلولی می باشد.
سلول ها می توانند در پتری دیش ها یا فلاسک هایی نگهداری شوند که مجهز به یک سری امکاناتند، از جمله اینکه می توان فلاسک ها را با CO2 گازدهی کرده و سپس آنها را محکم بسته (غیر قابل نفوذ)، به طوریکه نیاز به استفاده از انکوباتور CO2 مرتفع گردد. این حالت خصوصاً زمانیکه انکوباتور به خوبی کار نمی کند مفید خواهد بود. ظروف کشت سلول همیشه متناسب با روش کار انتخاب می شوند. گاهی ممکن است تعویض یک محیط کشت مصرف شده با یک محیط کشت دیگر ضروری باشد.

انتخاب ظرف به چندین عامل بستگی دارد: آیا کشت در یک سوسپانسون است یا کشت به صورت تک لایه می باشد؟ عملکرد سلول، آیا کشت به CO2 نیاز دارد یا نیاز ندارد؟ هزینه هم می تواند یک عامل محدود کننده باشد. عملکرد سلول متناسب با فضای سطح موجود است. تضمین رشد یک تک لایه سلولی یکنواخت در بسیاری موارد از اهمیت زیادی برخوردار است، به خصوص در ظروف کشت چند خانه ای (۹۶ ،۴۸ یا ۲۴) خانه ای.

شستشو و استریلیزه کردن وسایل
قابلیت دسترسی به طیف وسیعی از ظروف پلاستیکی کشت سلول، لزوم شستشو را به طور قابل توجهی کاهش داده است. به هر حال ظروف شیشه ای مثل پیپت ها باید در محلول شستشو دهنده خیسانده شوند و سپس فرآیند شستشو با خیساندن در آب مقطر به خوبی صورت گیرد. سپس فرآیند خشک کردن و استریلیزاسیون آنها انجام شده، به این شکل که مقداری پنبه در ورودی پیپت ها قرار داده و با کاغذ اتوکلاو آنها را کاملا محصور نموده و با دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ دقیقه اتوکلاو نمایید. همچنین ظروف شیشه ای مثل پیپت ها، فلاسک ها مخروطی و ارلن و بشرها (با یک پوشش آلومینیومی) در آون با دمای ۱۶۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱ ساعت استریل می شوند. شاخص های استریلیزاسیون مانند چسب های استریلیتی (چسب اتوکلاو) برای هر دسته از وسایلی که استریل می شوند، به منظور اطمینان از عملکرد موثر دستگاه های فوق ضروری می باشند. برای وسایلی که به صورت باز و بدون بسته بندی هستند، از کیسه های اتوکلاو استفاده نمایید. فویل های آلومینیومی نیز مورد خوبی برای بسته بندی نمودن این وسایل جهت اتوکلاو هستند.

نیتروژن مایع/ فریزر ( ۷۰-)
همواره چه برای لاین های سلولی که مکرراً تکثیر می شوند و چه لاین هایی که در نهایت از بین می روند، نمونه های از کشت جهت ذخیره سازی باید فریز شوند. این عمل به منظور ممانعت از جهش سلولی و محافظت از لاین سلولی در مقابل آلودگی و دیگر اتفاقات ناگوار صورت می پذیرد.
فرآیند فریز کردن سلول ها عموماً برای تمامی انواع سلولی صورت می گیرد. سلول ها باید در فاز تصاعدی رشد با یک نگهدارنده مناسب که معمولاً دای متیل سولفوکسید (DMSO) است فریز شوند. سلول ها معمولا ابتدا چند ساعت در ۲۰- درجه قرار داده می شوند و سپس در نیتروژن مایع ۱۹۶- درجه فرو برده می شوند (در ویال های کوچک درب بسته) یا اینکه در فاز گازی که در قسمت بالای مایع قرار دارد نگهداری می شوند. مواردی از تخریب و مرگ سلولی در ۷۰- درجه مشاهده شده است، بنابراین اولیت استفاده از نیتروژن مایع است. ویال ها را می توان در یک جعبه پلی استایرنی با دیواره های ۱ اینچی فریز نمود.

سیستم اسمزی معکوس
تهیه یک آب دوبار تقطیر شده یا اسمز معکوس برای آماده سازی محیط کشت و شستشوی ظروف شیشه ای ضروری است. pH آب دوبار تقطیر شده باید مرتباً چک شود، چرا که در مواردی امکان تغییر در pH وجود دارد. تنوع در کیفیت آب مورد استفاده ممکن است سبب تغییراتی در نتیجه شود، بنابراین آبی که از یک منبع می آید باید مورد استفاده قرار گیرد. آب با اتوکلاو شدن در ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ دقیقه استریل می شود. آب مقطر در صورتیکه برای تهیه محیط کشت است، باید در ظروف شیشه ای، استریل و نگهداری شود. نگهداری در ظروف پلاستیکی می تواند منجر به ورود مواد سمی از پلاستیک به درون آب گردد.

استریلیزاسیون فیلتری
محیط هایی که قابلیت اتوکلاو ندارند، باید به واسطه عبور از یک فیلتر غشایی با قطر منافذ ۲۲/۰ استریل شوند. این فیلتر ها در اندازه های مختلف به منظور فیلتراسیون طیف وسیعی از مواد با حجم های مختلف طراحی شده اند. این فیلترها می تواند به صورت یک بار مصرف و یا به صورت فیلتر هایی با قابلیت اتوکلاو همراه با یک نگهدارنده مناسب خریداری شوند. محیط های کشت، آنزیم ها، هورمون ها، کوفاکتورها و بافرهای بیکربنات نمونه ای از این مواد غیر قابل اتوکلاو هستند.

امکانات شمارش سلولی
امکان ردیابی رشد سلول ها به صورت چشمی وجود ندارد، اما دقت هرچه بیشتر در شمارش سلولی برای اغلب اهداف آزمایشگاهی مورد نیاز است. معمول ترین وسیله مورد استفاده جهت انجام شمارش سلولی، لام نئوبار هموسایتومتر است که اساساً برای شمارش سلول های خونی طراحی شده است. این لام ضخیم از یک سری خطوط عمودی و افقی به صورت مشبک تشکیل شده که میانگین تعداد سلول ها در ۴ خانه که خود از ۱۶ خانه کوچکتر تشکیل یافته اند، شمارش می گردد. سوسپانسیون سلولی پس از پیپتینگ مناسب جهت جدا شدن کامل سلول های چسبیده به هم در زیر لامل بر روی این لام لود می شود. پیپتینگ مناسب سوسپانسیون سلولی قبل از لود کردن بسیار اهمیت دارد، این کار به منظور دقت بیشتر و شکستن توده های سلولی به هم چسبیده که کار شمارش را با سختی مواجه می کند، صورت می گیرد. تعداد سلول های شمارش شده در این خانه ها در ۱۰۴ نشان دهنده میزان سلول ها در هر میلیمتر مکعب از سوسپانسیون است.

سایر تجهیزات مورد نیاز
علاوه بر وسایل و امکانات فوق تعداد دیگری از تجهیزات نیز برای انجام عمل کشت سلول مفید هستند. یک حمام آب گرم یا بن ماری و سانتریفیوژ برای انجام کار ضروری به نظر می رسد. یک پمپ مکشی جهت تسریع در مکش محیط کشت و مواد و جلوگیری از آلودگی مفید خواهد بود. پمپ باید به طور مناسبی مانع از بازگشت مایع به محیط کردد.
تجهیزات اضافی شامل پیپت های مدرج در سایز های مختلف، لوله ها و فلکون های سانتریفیوژ، نگهدارنده های عمومی، پیپت های یک بار مصرف و بالن های پلاستیکی جهت استفاده با پیپت ها هستند. میکرو پیپت های دقیق یا سمپلر (حجم های ۱ تا ۱۰۰۰ میکرولیتر) برای تیمار کشت ها با مواد شیمیایی مورد استفاده هستند. این میکروپیپت ها به صورت یک بار مصرف، قابل اتوکلاو و پلاستیکی موجود هستند. برای انجام آزمایشات اختصاصی نیز ممکن است به تجهیزات خاص دیگری نیاز باشد.