طراحی پرایمر و قواعد آن

قواعد مشخصی‌ برای‌ اینکه‌ بتوان‌ با اطمینان‌ یک‌ جفت‌ پرایمر موثر را انتخاب‌ کرد وجود ندارد. در حال‌ حاضر پرایمر بیش‌ از هر عامل‌ دیگری‌ عامل‌ موفقیت‌ یا شکست‌ در یک‌ واکنش‌ تکثیری‌ است. بعضی‌ قواعد و راهنمایی‌های‌ مفیدی‌ را در مورد طراحی‌ آغازگر بیان می‌کنند:  

1- طول‌ متوسط‌ هر پرایمر بین‌ 30-18 جفت‌باز باشد، زیرا پرایمر با طول‌ کوچک‌ اتصال‌ غیراختصاصی‌ را افزایش‌ داده و پرایمر بزرگ سرعت‌ هیبریداسیون‌ را کم‌ می‌کند.

2- مقدارG-C دو پرایمر با هم‌ مشابه‌ بوده‌ و حدود 50-60 درصد باشد.

3- آغازگرها باید از نظر مکمل‌ بودن‌ با هم‌ کنترل‌ شوند. (پرایمر دایمر یا آغازگر دوتایی‌ یک‌ تکثیر مصنوعی‌ است‌ که‌ اغلب‌ در محصول PCR ‌مشاهده می‌شود و عبارتست‌ از یک‌ قطعة دو رشته‌ای‌ که‌ طول‌ آن‌ تقریبا به‌ مجموع‌ دو پرایمر نزدیک‌ است‌ و هنگامی‌ مشاهده‌ می‌شود که‌ یک‌ پرایمر توسط‌ آنزیم‌ پلیمراز به‌ روی‌ پرایمر دیگر گسترش‌ یابد. مکانیزم‌ واقعی‌ که‌ چگونه‌ پرایمر دایمر تشکیل‌ می‌شود بدرستی‌ مشخص‌ نیست. پرایمرها با انتهای‌مکمل‌ َ3 مستعد تشکیل‌ دایمر هستند. ممکن است ضعف‌ در آنزیم Taq ‌ باعث‌ پلیمریزاسیون‌ مستقیم‌ الگوی ‌غیرهدف‌ شود. در هر حال‌ چنانچه‌ پرایمر دایمر بعنوان‌ مانعی‌ مشاهده‌ شوند می‌توان‌ آن‌ را تا حدودی‌ با غلظت‌ حداقل‌ پرایمر و آنزیم‌ کاهش‌ داد).

4- در انتهای‌ َ3 پرایمر باید حداقل یک C ‌یا G قرار گیرد در توالی‌هایی‌ که پرایمرهای آنها‌ دارای‌ انتهای‌ َ3 غنی‌ا زG یا C است، احتمال‌ اتصال‌ اشتباهی‌ افزایش‌ می‌یابد.

5- باید تا حد امکان‌ از توالی‌های‌ پالیندرومیک‌ داخل‌ پرایمرها جلوگیری‌ کرد.

6- نسبت‌ چهار نوکلئوتید در آغازگر حتی‌المقدور یکسان‌ باشد.

7- آغازگر به‌ توالی‌ تکرار شونده‌ ختم‌ نشود.

8- دمای Tm ‌دو آغازگر نزدیک‌ هم‌ باشد. (حدمجاز دمای‌ اتصال‌ پرایمر طراحی‌ شده ‌باید بین‌ 65-55 باشد. دمای‌ تکثیرایده‌آل‌ 72-62 می‌باشد).

9- درجه‌ حرارتی‌ که‌ پرایمر به DNA ‌ الگو متصل‌ می‌شود به‌ طول‌ آغازگر و مقدارGC آن‌ بستگی دارد برای‌ پرایمرهای‌ حاوی GC ‌50% و دارای‌ 20 نوکلئوتید، دمای‌ 55 درجه‌سانتیگراد پیشنهاد می‌شود، برای‌ افزایش‌ اختصاصی‌ عمل‌ کردن‌ آغازگر حتی‌ ممکن‌ است‌ دماهای‌ بالاتری‌ هم‌ مورد نیاز باشد.

برای‌ اینکه‌ هر پرایمر با رشته‌ الگوی‌ خودش‌ هیبرید شود لازم‌ نیست‌ که‌ عینا و کاملا مکمل رشتة الگو باشد، برای‌ طراحی‌ پرایمر اغلب‌ از برنامه‌های‌ کامپیوتری‌ ویژه‌ استفاده‌ می‌شود. فاصله‌ بین‌ پرایمرهایی‌ که‌ با DNAی‌ هدف‌ هیبرید می‌شوند بطور معمول‌ کمتر از 15 کیلو باز می‌باشد.‌‌‌‌ در حقیقت‌ یک‌ کاهش‌ اساسی‌ در سنتز موثر هنگامی‌ که‌ محصول‌ تکثیر متجاوز 1000 جفت‌باز می‌شود، مشاهده‌ می‌گردد. به‌ همین‌ دلیل‌ طول‌ قطعه‌ مورد تکثیر درPCR نباید بیش‌ از 3 کیلوباز باشد وحد مطلوب‌ کمتر از 1 کیلوباز می‌باشد. (‌‌‌‌تکثیر قطعات‌ بسیار طویل‌ و بالای 40 کیلوباز مقدور است‌ اما نیاز به‌ روش‌های‌ ویژه‌ای‌ دارد).

دمای‌ ذوب‌ آغازگر :

‌‌‌‌دمای‌ اتصال‌ باید بقدر کافی‌ پایین‌ باشد تا پرایمر و DNA الگو قادر به‌ اتصال‌ باشند و از سوی دیگر باید به‌ قدر مناسب‌ بالا باشد تا از تشکیل‌ اتصالات‌ غیراختصاصی‌ جلوگیری‌ کند. دمای‌ اتصال‌از روی‌ شاخصی‌ به‌ نام‌ درجه‌ حرارت‌ ذوب‌ محاسبه‌ می‌شود. دمای‌ ذوب‌ درجه‌ حرارتی‌ است‌ که‌ درآن‌ نیمی‌ از DNAها به‌ صورت‌ تک‌ رشته‌ای‌ درآمده‌اند. یکی‌ از مهمترین‌ مشخصات Tm ، ‌وابستگی‌ آن‌ به‌ ترکیب‌ بازی DNA است. گوانین و سیتوزین سه‌ پیوند هیدروژنی‌ و آدنین‌ و تیمین‌ دوپیوند هیدروژنی‌ دارند، بنابراین‌ هر چقدر مقدار گوانین‌ و سیتوزین‌ در DNA بیشتر باشد Tm بیشتراست. دمای‌ 2-1 درجه‌ سانتیگراد کمتر از Tm کافیست‌ که‌ هیبریداسیون‌ بین‌ پرایمر وDNAی‌ الگو در آن‌ صورت‌ گیرد. دمای‌ ذوب‌ بطور معمول‌ از طریق‌ فرمول‌ سادة زیر نیز محاسبه‌ می‌شود.

Tm = (4 * (G + C) + 2 *(A + T)) برای‌ هر پرایمر 20 نوکلئوتیدی‌

دو پرایمر باید طوری‌ طراحی‌ شوند که‌ دارای Tm ‌ یکسان‌ باشند در غیر اینصورت‌ حرارت‌ مناسب‌ برای‌ یک‌ پرایمر برای‌ جفت‌ دیگر نامناسب‌ خواهد بود.‌‌‌‌ بسیاری‌ از آزمایشگاه‌ها دمای‌ چسبیدن‌ را از 5-3 درجه‌ سانتیگراد زیر دمای‌ ذوبی (Tm) ‌ که‌ طریق‌ این‌ فرمول‌ محاسبه‌ شده‌است‌ درنظر می‌گیرند. از این‌ موضوع‌ نتیجه‌ گرفته‌ می‌شود که ‌پرایمرهای‌ با طول‌ زیاد باعث‌ افزایش‌ بالا رفتن‌ اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ نمی‌شود. (البته فرمول‌های دیگری نیز برای محاسبة Tm وجود دارند.)

غلظت‌ پرایمرها و روش‌ اندازه‌گیری‌ آن‌ :

‌‌‌‌غلظت‌ پرایمر بین‌ 50/0 تا 5/0 میکرومول‌ و حد مطلوب‌ 6/0 - 1/0 برای‌ یک‌ واکنش 25 میکرولیتری‌ می‌باشد. غلظت‌ بالای‌ پرایمر باعث‌ بسط‌ غیراختصاصی‌ و پرایمر دایمر می‌شود.

اتصال‌ پرایمر :

‌‌‌‌دما و مدت‌ زمان‌ لازم‌ برای‌ اتصال‌ پرایمر به طول‌ پرایمر، ترکیب‌ نوکلئوتید و غلظت‌ پرایمر بستگی‌ دارد.‌‌‌‌

با توجه‌ به‌ طیف‌ فعالیت‌ آنزیم Taq پلی‌مراز که‌ در محدوده‌ 58-20 درجه‌ سانتیگراد می‌باشد، دمای‌ اتصال‌ در محدودهِ 72-55 درجه‌ سانتیگراد بطور معمول‌ بهترین‌ نتیجه‌ را می‌دهد افزایش ‌دمای‌ اتصال‌ بسط‌ غیراختصاصی‌ را در انتهای‌ َ3 پرایمر کاهش‌ می‌دهد. دمای‌ پایین‌ تکثیر همراه‌ باغلظت زیاد،‌ اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ را کاهش‌ می‌دهد.

بسط‌ پرایمر :

‌‌‌‌مدت‌ زمان‌ بسط‌ بستگی‌ به‌ طول‌ توالی‌ هدف، غلظت‌ توالی‌ هدف‌ و دمای تکثیر دارد.‌‌‌‌ بسط‌ پرایمر بطورمعمول‌ در دمای‌ 72 درجه‌ سانتیگراد انجام‌ می‌شود (این زمان‌ برای‌ فرآورده‌های‌ معادل‌ 2 کیلو باز کافیست)‌.