توالی یابی دی ان ای (DNA sequencing)

اشکال عمده در تعیین توالی DNA دو رشته‌ای در مقایسه با DNAهای تک رشته‌ای در این است که حضور رشته مکمل در آزمایشات منجر به افزایش میزان خطاها در تعیین توالی می‌گردد. این خطاها به صورت مناطقی برروی ژل آشکار می‌شوند که در یک نقطه از ژل بیش از یک باند وجود دارد در نتیجه مشکل بتوان تصمیم گرفت که نوکلئوتید واقعی در این جایگاه کدام یک است. خطاهایی از این نوع تنها محدود به آنالیز DNA دو رشته‌ای نمی‌باشند و برخی از آنها یک مشکل عمومی در آزمایشات تعیین توالی می‌باشند. در صورت بروز این خطاها می توان برای رفع ابهام آزمایش را با یک پرایمر جدید با استفاده از رشته دیگر به عنوان الگو، تکرار کرد. در مورد توالی‌های بزرگتر از 700-600 نوکلئوتید حتی در صورت استفاده از DNA تک رشته‌ای در آنالیز توالی نیز همیشه نمی‌توان بدون بروز این خطاها محصولات واکنش‌ها را بر روی ژل الکتروفورز یا کاغذ کروماتوگرافی دقیقا از یکدیگر تفکیک نمود و البته این اندازه نوکلئوتیدی حداکثر طول توالی است که می‌توان توسط ترکیب ویژه‌ای از الیگو ـ پرایمر آنرا تشخیص داد.  
پیمایش با پرایمر (Primer walking )روشی دیگر برای تهیه الگو در آزمایشات تعیین توالی است. در این روش ابتدا یک پرایمر الیگونوکلئوتیدی که مکمل بخش انتهایی ناحیه شناخته شده یک توالی DNA است طراحی می‌گردد و پس با جفت کردن این پرایمر نشاندار با بخش مکمل آن، دنباله آن که در واقع بخش مکمل با ناحیه ناشناخته است سنتز می‌گردد و به این صورت کپی‌های تک رشته‌ای از ناحیه ناشناخته تهیه می‌شود که می‌توان در آزمایشات تعیین توالی از آنها استفاده کرد.
البته می‌توان در همین روش به جای سنتز رشته جدید، با حذف آنزیمی توالی‌های موجود در فرودست ناحیه اتصال پرایمر به الگو مجموعه‌ای از قطعات ناشناخته تهیه کرد.
یکی از روش هایی که در تاریخ علم تعیین توالی ژنوم کامل موجودات بسیار مهم  شده است روش تعیین توالی شکاری ((Shotgun sequencing است که در اوایل کشف تعیین توالی از آن استفاده می‌شد در این روش DNAیی که قرار است توالی آن مشخص شود به طور تصادفی شکسته می‌شود و آنگاه قطعات حاصل در یک پلاسمید یا حامل M13 کلون می‌شوند.
سپس از محل اتصال این قطعات به DNAی حامل همانند سازی در یک یا هر دو جهت آغاز می‌شود. فرایند تکثیر تا زمانی که مقدار DNAی تولید شده به 10ـ5 برابر DNA الگوی اولیه برسد ادامه می‌یابد و بعداً با استفاده از کامپیوتر هم پوشانی توالی‌های مختلف در این مجموعه DNA خوانده می‌شود و از این اطلاعات می‌توان برای تعیین توالی مولکول DNA اولیه استفاده کرد. هرچه تعداد این هم پوشانی‌ها که دارای نقاط شروع و پایان متفاوتی هستند و در جهتهای مختلفی نیز خوانده می‌شوند بیشتر باشد به همان میزان اطمینان از صحت توالی تعیین شده نیز بالاتر می‌رود.
با تعیین توالی هر 2 رشته مولکول DNA به طور مجزا و با تائید مکمل بودن آنها می توان خطاهای تولید شده در زمان آزمایش یا در طی مرحله الکتروفورز را تشخیص داده و حذف کرد. امروزه روش های خودکار تعیین توالی تغییری اساسی در سرعت و جهت گیری پرو‍ژه‌های ژنومی ایجاد کرده است. از طریق این روش ها تا زمان نگارش کتاب توالی کامل ژنوم بسیاری از باکتریها چون مخمر Saccharomces cerevisiae و Caenorhabditis تعیین شده است و پروژه ژنوم انسانی نیز رو به کامل شدن است.
تهیه الگو برای آزمایشات تعیین توالی
در روش خاتمه زنجیره برای تعیین توالی DNA می بایستی از DNA تک رشته‌ای استفاده شود تا پرایمر امکان یابد بدون هیچ ممانعتی به الگوی خود دسترسی داشته باشد. یکی از روش های تهیه DNA تک رشته‌ای تزریق فرم دو رشته‌ای آن به یک ویروس باکتریایی است که این ویروس به طور طبیعی تنها یکی از دو رشته را به میزبان باکتریایی خود وارد می‌کند.
البته با استفاده از این روش یک مرحله دیگر را به آزمایشات تعیین توالی می‌افزاید و علاوه بر وقت گیری این روش، انجام آن نیز همواره راحت و موفقیت آمیز نیست. روش دیگر واسرشت کردن DNA دو رشته‌ای توسط محلولهای قلیایی است که در این صورت باید قبل از دوباره چسبیدن رشته‌ها به یکدیگر پرایمر را به آنها افزود با این روش تجزیه و تحلیل DNAهای دو رشته‌های نیز امکان پذیر می‌باشد و امروزه بیشتر از این روش استفاده می‌شود.
توالی یابی پایان دهی زنجیره (انجام واکنش‌های سنتز رشته)
تا این مرحله شما DNA الگو تک رشته‌ای را تهیه کرده‌اید و اکنون جهت انجام واکنش‌های سنتز رشته آماده هستید. این واکنش‌ها با چهار خانواده از پلی نوکلئوتیدهای پایاندهی زنجیره انجام می‌شوند و سپس در الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید لود می‌گردند.
واکنش‌های سنتز رشته آسانترین بخش از روش توالی یابی DNA می‌باشند. اگرچه تعدادی از معرف های ((Reagents مختلف باید با همدیگر مخلوط شوند، ولی این مرحله نسبت به مرحله هضم برشی پیچیده‌تر نمی‌باشد. بطور کلی در همه روش های بیولوژی مولکولی، اگر از معرف های با کیفیت خوب استفاده گردد و پیپت نمودن ((Pipetting به دقت انجام شود، تقریباً آزمایش همیشه موفقیت آمیز خواهد شد. واکنش‌های توالی‌یابی DNA با در دسترس بودن کیت‌های تجارتی توالی یابی، آسانتر انجام می‌شوند. این کیت‌ها محتوی معرفهای پیش مخلوط ((Premixed بوده و دستورالعمل‌های دقیقی در خصوص چگونگی استفاده از آنها را نیز دارا می‌باشند و به مهارت‌های خاصی نیز نیاز ندارند، چون در بیشتر کیت‌ها، معرف ها  دارای کدهای رنگی می‌باشند؛ اما کیت‌های مورد استفاده باید قابل اطمینان باشند. در حقیقت در استفاده از مخلوط معرف های مربوط به کیت‌ها جهت توالی‌یابی، درک چگونگی عمل آنها نیز مهم می‌باشد. اگر شما نفهمید لوله آبی چه کاری انجام می‌دهد یا این که حمام آبی 37 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه باعت چه عملی می‌شود، نمی‌توانید اشتباهات احتمالی را رفع کنید و تحقیق به بن بست می‌رسد. در پست های بعدی، هریک از معرف هایی که در واکنش‌های سنتز رشته استفاده می‌شوند؛ بررسی می‌گردند
1ـ اجزای تشکیل دهنده واکنش های سنتز رشته
نخست باید وقایعی که در مدت واکنش های سنتز رشته روی می‌دهد را بررسی کنیم. نخستین مرحله اتصال یا چسباندن یک پرایمر الیگونوکلئوتیدی کوتاه به هر یک از مولکول های الگوتک رشته‌ای می‌باشد. پرایمر به عنوان نقطه شروع یک زنجیره پلی نوکلئوتیدی جدید که مکمل رشته الگو است؛ عمل می‌کند. سنتز رشته توسط آنزیم DNA پلی مراز انجام می‌شود و به دی اکسی نوکلئوتید تری فسفات‌ها به عنوان سوبسترا نیاز دارد. معمولاً یک یا چند تا از این dNTPS ((Deoxynucleotide triphosphates با یک نشانگر رادیواکتیو(Redioactive marke) برچسب دار می‌شوند تا بعداً الکتروفورز ژل و اتورادیوگرافی قابل رؤیت باشند. هنگامی که نوکلئوتید پایاندهی زنجیره در مخلوط واکنش قرار گیرد؛ سنتز رشته متوقف می‌شود و بدین ترتیب امکان ایجاد چهار خانواده از مولکول های پایان دهی زنجیر وجود خواهد داشت. به طوری که یک خانواده شامل پلی نوکلئوتیدهایی است که به A ختم  می‌شوند؛ خانواده دوم به C ختم می‌گردند و الی آخر. چهار خانواده سپس توسط الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید تفکیک می‌شوند تا الگوهای باندی Banding pattern) به دست آید که از روی آنها، توالی خوانده می‌گردد.
1ـ1ـ پرایمر
DNA پلی مراز وابسته به الگو قادر به شروع سنتز DNA در یک مولکول DNA تک رشته‌ای، بدون وجود پرایمر نخواهد بود. در حقیقت یک ناحیه دو رشته‌ای کوتاه مورد نیاز است تا انتهای 3 را فراهم نموده تا پلی مراز بتواند نوکلئوتیدهای جدید را اضافه کند. این انتهای 3 را پرایمر فراهم می‌کند و بدون آن سنتز رشته انجام نمی‌شود. ممکن است چنین تصور کنید که استفاده از پرایمر در آزمایش توالی یابی DNA دردسر ساز است؛ چون نیاز به یک مرحله اضافی در توالی یابی دارد. در واقع پرایمر یک نقش حساسی را در روش پایان دهی زنجیره بازی می‌کند؛ زیرا پرایمر نقطه شروع واکنش های سنتز رشته را تعیین می‌کند.
استفاده از پرایمر موارد ذیل را تأمین می‌کند:
الف) همه رشته‌های سنتز شده به وسیله DNA پلی مراز یک انتها خواهند داشت. از آن جایی که طول های زنجیره‌های پایان یافته، توالی رشته الگو را منعکس می‌نمایند؛ وجود یک انتها برای همه رشته‌ها ضروری است.
ب) تنها بخش مورد نظر از مولکول الگو توالی یابی می‌گردد.
مورد دوم بسیار مهم است؛ زیرا در یک آزمایش توالی‌یابی بیش از چند صد جفت باز را نمی‌توان به دست آورد. در حالی که مولکول الگو (ناقل به همراه DNA وارد شده) چندین کیلو باز طول دارد. بنابراین باید هر آزمایش توالی‌یابی در ناحیه خاصی از الگو که مد نظر است هدایت گردد. در عمل، همیشه از پرایمری استفاده می‌شود که در مجاورت یکی از اتصال ها، بین ناقل و DNA وارد شده، به مولکول الگو می‌چسبد. این مکان ایده آلی برای شروع سنتز رشته می‌باشد؛ زیرا که DNA پلی مراز فوراً شروع به خواندن DNA وارد شده می‌کند. بنابراین قطعه DNA همسانه شده توالی‌یابی می‌گردد. جایگاه اتصال پرایمر در درون ناحیه Lacz مولکول ناقل نشان داده شده است. از آن جایی که این ناحیه دارای توالی یکسانی در همه ناقل‌های حاوی ‍ژن Lacz می‌باشد (همه ناقل‌های M13 و ناقل‌های فاژمید)، بنابراین سنتز پرایمرهای مختلف برای هر آزمایش توالی‌یابی ضروری نیست. در حقیقت یک پرایمر جهانی (پرایمری که توالی آن مکمل قطعه مربوط به ژن Lacz است) برای همه آزمایشات صرف نظر از منشاء DNA همسانه شده مناسب خواهد بود.
از نظر تئوری، سنتز رشته می‌تواند با پرایمرهای کاملاً کوتاه با اندازه‌ای در حدود 2 نوکلئوتید شروع شود. در عین حال باید مطمئن شویم که پرایمر به مکان هدف بچسبد و چسبیدن آن با شانس و تصادف نباشد. همچنین به مکان ثانویه در الگو متصل نگردد. اگر این حالت اتفاق بیفتد دو توالی به دست آمده در ژل پلی اکریل آمید روی هم تأثیر گذاشته و هیچ کدام قابل خواندن نخواهند بود. بیشترین پرایمرهای جهانی که به طور تجارتی قابل دسترس هستند 24ـ15 نوکلئوتید دارند. این اندازه شانس اتصال دوگانه (Universal primer) پرایمر را به حداقل می‌رساند. الیگونوکلئوتیدی که 15 نوکلئوتید طول دارد 15mer و اگر 20 نوکلئوتید طول داشته باشد 20mer گفته می‌شود.
آیا نیاز است که شما از یک پرایمر به غیر از پرایمر جهانی استفاده کنید؟ در برخی موارد پرایمری که به درون DNA وارد شده می‌چسبد، نسبت به پرایمری که به یک طرف آن می‌چسبد ترجیح داده شود؛ به طوری که استفاده از این پرایمر شما را قادر می‌سازد تا توالی ناحیه‌ای از DNA وارد شده را به دست آورید که از نقطه اتصال ناقل ـ DNA وارد شده (Insert Vector junction ) (جهت توالی یابی با یک پرایمر جهانی) خیلی دور است. بنابراین از پرایمرهای درونی ((Internal Primers جهت به دست آوردن توالی کامل یک DNA وارد شده (که با پرایمرهای جهانی قابل توالی‌یابی نمی‌باشد) می‌توان استفاده نمود.
اگرچه این روش ممکن است یک ایده مطلوب به نظر برسد، اما استراتژی های زیر همسانه سازی، راه های بهتری برای به دست آوردن توالی‌های طولانی می‌باشند. پرایمرهای درونی چندین عیب دارند که عمده‌ترین آن هزینه ی بالای تهیه یک الیگونوکلئوتید خاص برای هر آزمایش توالی‌یابی می‌باشد.
هریک از زیر همسانه‌سازی تولید شده به وسیله ی یکی از استراتژی‌های ذکر شده می تواند با پرایمرهای جهانی توالی‌یابی شود.
1ـ2ـ DNA پلی‌مراز
هر آنزیمی که DNA را سنتز کند DNA پلی مراز نامیده می‌شود. بیشتر DNA پلی مرازها وابسته به الگو  (Template - dependent ) هستند. این بدان معنی است که رشته DNA جدید از روی الگو تک رشته‌ای موجود سنتز می‌شود و توالی رشته جدید مکمل توالی الگو است. برخی از آنزیم‌ها از الگو DNA استفاده می‌کنند؛ از این رو پلی مرازهای وابسته به DNA می‌باشند. برخی دیگر از RNA  استفاده می‌کنند. پلی مرازهای DNA وابسته به RNA را ترانسکریپتازهای معکوس (نسخه برداری‌های معکوس) (Reverse transcriptases) می‌نامند. تمامی DNA پلی مرازها، DNA را در جهت 5 پرین به 3 پرین سنتز می‌نمایند، یا به عبارت دیگر نوکلئوتیدها را به انتهای 3 پرین رشته در حال ساخت اضافه می‌نمایند.
از آن جایی که سنتز در جهت 5 پرین به 3 پرین است، پس الگو باید در جهت 3 پرین به 5 پرین خواندن شود، زیرا که دو رشته یک مولکول اسید نوکلئیک دو رشته‌ای همیشه در جهت مخالف هم هستند.
تمامی موجودات زنده دارای DNAهای پلی مراز می‌باشند. این آنزیم‌ها نقش اساسی را در همانند سازی و تعمیر مولکول هایDNA سلول بازی می‌کنند. به علاوه بسیاری از باکتریوفاژها و ویروس‌ها دارای ژنهایی هستند که این ژنها بعد از آلودگی، باعث سنتز DNA پلی مرازهای جدیدی می‌گردند، تا به کمک آنها فاز یا DNA ویروسی همانند سازی گردد. بنابراین تعداد زیادی DNA پلی مراز مختلف با خواص متفاوت وجود دارد. یک DNA پلی مراز زمانی برای توالی یابی DNA مناسب است که برخی معیارها را داشته باشد. مهمترین این معیارها قدرت عمل بالا  (High processivty) و فعالیت اگزوتوکلئازی پایین (Low exonuclease activity) می‌باشد. در چند صفحه بعد این معیارها و همچنین شاخص‌های کم اهمیت دیگر (به عنوان خواصی که یک آنزیم ایده‌آل توالی‌یابی DNA باید دارا باشد) را مرور خواهیم نمود. سپس تعداد از DNA پلی مرازهایی که در توالی یابی DNA استفاده می‌شوند را بیان و نقاط ضعف و قوت هریک را ارزیابی خواهیم کرد.
1ـ2ـ1ـ قدرت عمل
قدرت عمل اشاره دارد به طول رشته جدیدی که یک DNA پلی مراز قادر است سنتز نماید، قبل از اینکه واکنش از طریق عوامل طبیعی پایان یابد. هیچ DNA پلی مرازی بطور نامحدود قادر به سنتز DNA نمی‌باشد،به طوری که پایاندهی زنجیره در نقاطی که آنزیم از الگو جدا می‌شود اتفاق می‌افتد یک آنزیم باقدرت عمل پایین برای توالی یابی DNA مناسب نمی‌باشد، زیرا ممکن است قبل از اینکه یک نوکلئوتید پایاندهی زنجیره درج شود از مولکول الگو جدا شود. بنابراین رشته‌هایی که به طور تصادفی از این طریق پایان یافته‌اند، تولید یکسری باندهای اضافی در ژل پلی اکریل آمید می‌نمایند که خواندن توالی را غیر ممکن و یا مشکل می‌نمایند. از اینرو آنزیم‌های توالی‌یابی باید قدرت عمل بالایی داشته باشند.
1ـ2ـ2ـ فعالیت‌های اگزونوکلئازی
بسیاری از DNA پلی مرازها آنزیم‌های دوکاره (Dual function) هستند، یعنی از یک طرف قادر به سنتز و از طرف دیگر قادر به حذف نوکلئوتیدها از زنجیره می‌باشند. این حالت ممکن است منحصر به فرد به نظر برسد، اما با وظایفی که این آنزیم‌ها در سلول ایفا می‌کنند مطابقت دارد. به عنوان مثال DNA پلی مراز  E.coli J یک آنزیم تعمیری DNA می‌باشد. یعنی به منظور تصحیح اشتباهاتی که در طول همانند سازی DNA یا در اثر موتاسیون رخ داده است، مبادرت به حذف نوکلئوتیدهای یک رشته DNA می‌نماید. جهت انجام این عمل آنزیم به یک فعالیت اگزونوکلئازی 5 پرین به 3 پرین نیاز دارد. به علاوه DNA پلی مراز I، مانند بیشتر DNA  پلی مرازهای دیگر دارای عمل خواندن ضعیفی است و این کمک می‌کند تا هر اشتباهی که در طول سنتز DNA رخ داده است تصحیح گردد. آنزیم باید در جهت عکس حرکت نماید تا نوکلئوتیدهای اشتباه را از رشته‌های DNA در حال سنتز حذف نماید. از این رو این آنزیم به فعالیت اگزونوکلئازی در جهت 3 پرین به 5 پرین  نیاز دارد. بنابراین دو نوع فعالیت اگزونوکلئازی برای تصحیح عملکرد آنزیم DNA پلی مراز مورد نیاز است. متاسفانه هر دو نوع فعالیت اگزونوکلئازی در طول توالی یابی پایاندهی زنجیره ایجاد مزاحمت می‌کنند. عمل اگزونوکلئاز 5 پرین به 3 پرین یک مشکل اساسی‌تر می‌باشد، زیرا آنزیم‌هایی که دارای این خاصیت هستند می‌توانند نوکلئوتیدها را از انتهای 5 پرین رشته پایاندهی زنجیره حذف نمایند. اگر این عمل اتفاق بیافتد، اندازه‌های مولکول های پایاندهی زنجیره متغیر گردیده و توالی الگو را منعکس نمی‌سازند و در نتیجه الگوی بانددهی درژل پلی اکریل آمید قابل تفسیر نخواهد بود. بنابراین برای اینکه توالی یابی پایاندهی زنجیره به خوبی انجام گیرد لازم است که DNA پلی مراز فاقد یا دارای فعالیت ناچیز اگزوتوکلئازی 5 پرین به 3 پرین باشد.
همچنین عمل اگزونوکلئاز 3 پرین به 5 پرین کمی مشکل ساز است. در حقیقت عملی که توسط فعالیت این اگزونوکلئاز انجام می‌گیرد دردسر ساز است، به طوری که ممکن است نوکلئوتیدهای غیر عادی (تغییر شکل یافته) مانند دی اکسی اینوزین تری فسفات  (Deoxyinosine triphosphate) به مخلوط واکنش اضافه شوند. این نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته تحت شرایط خاصی استفاده می‌شوند تا نتایج آزمایش توالی‌یابی بهبود یابد. مشکل اینجاست که بسیاری از پلی مرازهای، با عمل خواندن ضعیف، قادر به تشخیص و حذف نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته خواهند بود. این عمل هدف استفاده نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته را در نخستین موقعیت بی‌اثر می‌سازد. خواندن ضعیف حتی قادر است با حذف نوکلئوتید پایاندهی زنجیره (به محض اضافه شدن) از پایان یافتن زنجیره جلوگیری نماید. علاوه براین یکسری مشکلات دیگر وجود دارد که عموماً به اگزونوکلئاز 3 پرین به 5 پرین نسبت داده می‌شوند. بنابراین پلی مراز ایده‌آل جهت توالی یابی باید خاصیت اگزونوکلئازی نداشته باشد.
1ـ2ـ3ـ خصوصیات دیگر پلی مراز ایده‌ال برای توالی یابی DNA
علاوه بر قدرت عمل بالا و فعالیت اگزونوکلئازی پایین، DNA پلی مراز  ایده‌آل برای توالی یابی پایاندهی زنجیره باید خصوصیات زیر را نیز داشته باشد:
1ـ در دمای 55 درجه سانتی گراد و بالاتر از آن فعالیت نماید
یک مشکل عمده آزمایش توالی‌یابی این است که بخشهایی از الگو، به واسطه جفت شدن بازها بین نواحی مختلفی از مولکول تک رشته‌ای، خارج از دسترس می‌شوند. این نوع جفت شدن باعث ایجاد ساختارهای ثانویه (Secondary structures ) از قبیل حلقه‌های سنجاق سری (Hairpin loop) می‌گردد که DNA پلی مراز نمی‌تواند در آن نفوذ نماید، بنابراین از سنتز رشته ممانعت می‌شود. اگر DNA وارد شده غنی از GC باشد این مشکل حادتر می‌گردد، زیرا جفت بازهای G-C محکم‌تر از A-T  هستند. بنابراین مقاومت بیشتری در دمای 37 درجه سانتی گراد نشان می‌دهند (درجه حرارت مناسب برای پلی مرازها). یک راه حل مناسب برای مشکل ساختار ثانویه، انجام واکنش های توالی‌یابی دردمای 55 درجه سانتی گراد یا حتی بالاتر، می‌باشد. درجه حرارت بالا (تبخیری) (Elevated temperature)
این نوع جفت شدن را بی ثبات کرده و DNA الگو را برای فعالیت DNA پلی مراز از هم باز می‌نماید. این راه حل فقط زمانی عملی است که DNA پلی مراز قادر باشد در درجه حرارت بالاتر کار خود را به خوبی انجام دهد.
2ـ توانایی استفاده از نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته به عنوان سوبستراها
قبلاً دیدیم که چگونه خواندن ضعیف بعضی آنزیم‌ها که توسط فعالیت اگزونوکلئازی حاصل می‌گردد، می‌تواند نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته را به همان سرعتی که پلی مراز DNA آنها را اضافه می‌کند از زنجیره در حال رشد حذف نماید. مشکل مشابه دیگر زمانی بوجود می‌آید که پلی مراز قادر به استفاده از نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته به عنوان سوبسترا نباشد، در این صورت آنها را نخسیتن موقعیت به رشته اضافه نمی‌کند. بعضی DNA پلی مرازها در خصوص انواع نوکلئوتیدهایی که استفاده می‌کنند خیلی محتاط هستند و ممکن است قادر به تشخیصddNTPs ، dITP و دیگر نمونه‌های تغییر شکل یافته نباشند. از این رو این نوع آنزیم‌های پلی مراز برای توالی یابی DNA مناسب نیستند.
3ـ سرعت سنتز رشته
سرعتی که در آن یک DNA پلی مراز، DNA جدید را سنتز می‌کند مهم می‌باشد، زیرا نمی‌خواهیم که واکنش های سنتز رشته در یک مدت زمانی طولانی انجام گیرد. بیشتر DNA پلی مرازها متوسط سرعت سنتز 10 نوکلئوتید در یک ثانیه را دارند. از اینرو از نظر تئوری قادر به پلی مریزه کردن 500 نوکلئوتید در کمتر از یک دقیقه هستند. در عمل ممکن است این سرعت خیلی کند باشد، مخصوصاً اگر الگو دارای چندین ناحیه حلقه سنجاق سری باشد که بواسطه توالی نوکلئوتیدی آنها سبب کند شدن سرعت پلی مراز شوند. بنابراین پلی مراز ایده‌آل توالی یابی باید یک سرعتی از طویل شدن (Elongation) (صدها نوکلئوتید در هر ثانیه) را داشته باشد.
1ـ2ـ4ـ DNA پلی مرازهای مورد استفاده در توالی یابی DNA
در مطالعات قبلی بیان کردیم که DNA پلی مراز ایده آل برای توالی یابی پایاندهی زنجیره باید قدرت عمل بالایی داشته باشد، فعالیت اگزونوکلئازی آن کم باشد، در درجه حرارت‌های بالا فعال باقی بماند، قادر به استفاده از نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته به عنوان سوبسترا باشد و سرعت طویل شدن آن حداقل چند صد نوکلئوتید در هر ثانیه باشد.
آیا چنین آنزیمی موجود است؟
در واقع چندین DNA پلی مراز متمایز وجود دارد که به قدر کافی از این معیارها برخوردار می‌باشند تا در آزمایشات توالی یابی بطور منظم استفاده شوند. یکی از این آنزیم‌های تغییر شکل یافته DNA پلی مراز Tv می‌باشد که سکوناز نامیده می‌شود، که آنزیم ایده‌آلی جهت توالی یابی می‌باشد. ابتدا این آنزیم را شرح داده و سپس شایستگی آنزیم‌های دیگر را بحث خواهیم نمود.
1ـ3ـ دی اکسی نوکلئوتید تری فسفات‌ها
همانطوری که می‌دانید DNA از طریق پلی مریزاسیون دی اکسی نو کلئوتیدتری فسفات‌ها (dNTPs) (Deoxynucleotide triphosphates) سنتز می‌شود. بنابراین در یک آزمایش توالی یابی پایاندهی زنجیره هر یک از چهار   dNTPsاستاندارد (dTTP و dGTP و dCTP و dATP) در مخلوط‌های واکنش وجود دارند. اما نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته چگونه استفاده می‌شوند؟
عموماً در توالی‌یابی پایاندهی زنجیره دو نوکلئوتید تغییر شکل یافته استفاده می‌شود (1979 Mills and Kramer، 1986 Barr et al):
1ـ نوکلئوتید دی اکسی آینوزین تری فسفات.
2ـ نوکلئوتید dGTP ـ deazea ـ 7.
هر دو نوکلئوتید از انواع تغییر شکل یافته dGTP هستند و هر دو زمانی استفاده می‌شوند که توالی الگو دارای ساختارهای حلقه سنجاق سری درون رشته‌ای باشد. قبلاً اثر ساختار حلقه سنجاق سری را در الگو بررسی نمودیم و بیان کردیم که با انجام واکنش های سنتز رشته در دمای 55 درجه  یا حتی 72 درجه سانتی گراد این نوع جفت شدن بازها شکسته می‌شود. این روش برای رشته الگو مناسب است اما در خصوص رشته‌های پایاندهی زنجیره که بعداً سنتز می‌شوند چطور؟ این رشته‌های جدید مکمل الگو هستند به این معنی که آنها توانایی زیادی در ایجاد حلقه‌های سنجاق سری دارند. این مشکل زمانی عمده می‌شود که رشته‌های پایاندهی زنجیره با ژل پلی اکریل آمید تفکیک شوند، زیرا حلقه‌های سنجاق سری درون مولکول DNAمی‌توانند بر تحرک الکتروفورزی اثر بگذارند. به جای اینکه الگوی باندی دقیقی به دست آید برخی از باندها خیلی سریع و برخی خیلی کند حرکت کرده و از هم فاصله زیادی می‌گیرند که منجر به هم فشردگی (متراکم) ((Compressions باندها شده و توالی DNA قابل خواندن نخواهد بود. نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته توانایی مولکول های پایاندهی زنجیره جهت شکل گرفتن حلقه‌های سنجاق سری را کاهش می‌دهند. هیچ کدام از نوکلئوتیدهای dIITP و deazea ـ vdGTP قادر به ایجاد جفت بازهای پایدار با باقی مانده‌های C نیستند. اگر هریک از این نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته به جای dGTP در واکنش های سنتز رشته استفاده گردند، مولکول های به دست آمده قادر به ایجاد جفت بازهای G-C بین رشته‌ای نخواهند بود. این بدین مفهوم است که تنها جفت بازهای A-T می‌توانند تشکیل شوند و تحت شرایط عادی به فدر کافی قوی نیستند تا حلقه‌های سنجاق سری پایدار ایجاد کنند. بنابراین فشردگی‌ها در ژل توالی‌یابی اغلب می‌تواند با استفاده از dITP و deaza ـ dGTP 7 از بین برود.
پلی مرازهای سکوناز، کلئو و DNA پلی مراز Vent قادرند از نوکلئوتیدهای dITP و dGTP ـ deaza ـ 7 با کارایی متفاوت به عنوان سوبسترا استفاده نمایند. DNA پلی مراز Taq می‌تواند از deaza7 استفاده کند ولی نمی‌تواند از dITP استفاده نماید. اگر فشردگی باندها یک مشکل باشد، dITP اولین انتخاب خواهد بود، زیرا که این نوکلئوتید منجر به نتایج بهتری نسبت به dGTP ـ deaza ـ 7 می‌شود. در عین حال نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته بطور معمول استفاده نمی‌شوند، چون هر دوی آنها وضوح الگو باندهای در ژل توالی‌یابی را کاهش می‌دهند.
1ـ4ـ نوکلئوتید برچسب دار شده (Labelled nucleotide )
بعد از اینکه رشته‌های پایاندهی زنجیره در ژل توالی یابی ران شدند نیاز است که باندها قابل مشاهده گردند. معمولاً در استفاده از ژل آگارز از اتیدیوم بروماید (Ethidium bromide) برای رنگ آمیزی استفاده می‌شود تا باندها در زیر اشعه ماوراء بنفش قابل مشاهده باشند. اتیدیوم بروماید به DNA در ژل می‌چسبد و سپس در پاسخ به اشعه ماوراء بنفش متشعشع می‌گردد و مکان باندها آشکار می‌گردد. اگر ژل توالی یابی با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شود ممکن است تعداد باندهای کمی مشاهده شود و میزان حساسیت و تجزیه و تحلیل برای توالی‌یابی مناسب نخواهد بود. از اینرو معمولاً در واکنش های سنتز رشته از یک نوکلئوتید برچسب دار رادیواکتیوی ((Radiolabelled nucleotide استفاده می‌شود و الگوی باندی به وسیله ی اتورادیوگرافی قابل رویت می‌گردد.
یکی از دو نوکلئوتید برچسب دار زیر در واکنش های توالی یابی استفاده می‌شود:
1ـ dNTP برچسب دار با 32P در موقعیت آلفا
2ـ  dNTPبرچسب دار با 35S با جایگزینی O بار متصل به فسفر آلفا
تفاوت اصلی بین دو نوکلئوتید برچسب دار رادیواکتیو، در انتشار انرژی اتم‌های رادیواکتیو می‌باشد. ذرات بتا منتشر شده به وسیله ی 32P تقریباً 10 برابر انر‍ژی بیشتری نسبت به 35S دارند. در عمل این بدان معنی است که:
اگر از  [35P]dNTP استفاده شود، اتو رادیوگرافی برای مدت نسبتاً کوتاهی انجام می‌گیرد.
برچسب کردن با 35P باعث ایجاد باندهای تیره و نامعلوم ( (Fuzzier bands به دلیل پخش شدن در درون فیلم اشعه X می‌شود.
رشته‌های برچسب دار با 32P ناپایدار هستند، بنابراین ژل پلی اکریل آمید باید فورا بعد از واکنش های توالی یابی ران گردد. در این حالت نمی‌توان مولکول های پایاندهی زنجیره را ذخیره نموده و روز بعد مورد استفاده قرار داد.
32P نسبت به 35P سلامت را بیشتر به خطر می‌اندازد.
علاوه بر 32P و 35S اخیراً نوکلئوتیدهای 33P نیز قابل دسترس شده‌اند. انتشار انر‍ژی 33P بین مقادیر  32P و 35S می‌باشد. (Mev 71/1، MeV 249/0، 33P - Mev167/0 ، 35S). این بدان معنی است که  32P دارای فواید 35S است به جز اینکه زمان آشکار سازی کمتری را نیاز دارد.
از اینرو بیشتر آزمایشات توالی یابی با  [35S]dNTP انجام می‌شود. در این حالت اتورادیوگرافی باید برای مدت طولانی‌تری صورت گیرد اما به طور کلی نتایج بهتری به دست می‌آید. یک نوع برچسب‌دار از هریک از چهار dNTP ها می‌توانند در واکنش های توالی یابی استفاده شوند، اما dGTP را با dITP یا dGTP ـ deazaـ 7 جایگزین کنید. بهترین شاخص جهت انتخاب و استفاده از یک نوکلئوتید برچسب دار رادیواکتیو محتوای GC مولکول DNA مورد توالی یابی می‌باشد. اگر محتوای GC بالا باشد بهتر است از dCTP برچسب دار استفاده شود در صورتیکه اگر این مقدار پایین باشد از dATP برچسب دار استفاده می‌شود. از این طریق بیشترین میزان برچسب در هریک از مولکول های پایاندهی زنجیره درج می‌گردد و زمان لازم برای اتورادیوگرافی کاهش می‌یابد.
1ـ5ـ نوکلئوتید پایان دهی زنجیره
معرفی دی دزوکسی نوکلئوتیدها (ddNTPs) یکی از ابداع های کلیدی بود که توالی پایاندهی زنجیره را بسیار موثر نمود (1977Sanger et al ) یک ddNTP فاقد گرون هیدروکسیل ( (Hydroxyl group متصل به کربن 3 پرین در تشکیل پیوند فسفودی استر (Posphodiester) شرکت می‌کند، اما بدون گروه هیدروکسیل واکنش نمی تواند ادامه پیدا کند. بنابراین درج یک ddNTP مانع طویل شدن رشته می‌شود. در حقیقت تنها راه ادامه طویل شدن، حذف دی دزوکسی نوکلئوتید از رشته ‌DNA می‌باشد. اگر آنزیم توالی‌یابی فاقد فعالیت اگزونوکلئازی 3 پرین به 5 پرین باشد، حذف دی دزوکسی نوکلئوتید غیر ممکن خواهد بود و بنابراین زنجیره پایان یافته باقی می‌ماند
واکنش های توالی یابی
شما DNA الگو را تهیه کرده‌اید و اجزاء واکنش توالی یابی را فراهم نموده‌اید. اکنون باید آنها را با هم مخلوط نمائید تا رشته‌های DNA پایان دهی زنجیره ساخته شوند. چندین روش مختلف برای انجام دادن واکنش های سنتز رشته وجود دارد. ابتدا عمومی ترین روشی یعنی روش پایان دهی برچسب دار (Labelling – termination) توضیح داده می‌شود (b1987. Taborand Richardson).

2ـ1ـ روش پایان دهی برچسب دار (برچسب دار کردن انتهایی): دو مرحله اصلی در این روش وجود دارد.
2ـ1ـ1ـ اتصال پرایمر به الگو
ادامه دادن (بسط دادن) پرایمر چسبیده از طریق سنتز رشته، جهت تولید مولکول های پایان دهی زنجیره.
آزمایش می‌تواند در لوله‌های میکروفوژ پلی پروپیلن (Polypropylen microfuge tubes) (با اندازه های 5/0 یا 5/1 میلی لیتر) انجام گیرد. اگر هدف تعیین توالی چندین الگو به طور همزمان باشد؛ از سینی (طبق) میکروتایتر 96 چاهکی (96-Well-Microtitre tray) استفاده می‌شود. سینی میکروتایتر باید ته گرد باشد. همچنین به یک استوانه چرخان مخصوص در محل بالای سانتریفوژ نیاز خواهد داشت تا با چرخانیدن سینی معرف ها با هم مخلوط شوند.
2ـ1ـ2ـ چسباندن پرایمر
مرحله نخست هر روش توالی یابی پایان دهی زنجیره چسباندن پرایمر الیگونوکلئوتید به مولکول DNA الگو است. هنگامی که این مرحله را انجام می دهید؛ دستیابی به دو چیز باید مد نظر باشد:
1ـ تخصصی بودن اتصال پرایمر (Specificity) 2ـ کارایی اتصال پرایمر (Efficiency)
1ـ تخصصی بودن اتصال پرایمر
تخصصی بودن به این معنی است که پرایمر بایستی فقط به مکان مورد نظر (پایین دست ناحیه ای که قرار است توالی یابی شود) در الگو بچسبد. اگر پرایمر به مکان های دیگر نیز بچسبد؛ بیش از یک سری از مولکول های پایان دهی زنجیره تولید خواهد شد، و در آن واحد، دو توالی به دست خواهد آمد و خواندن توالی را دچار مشکل خواهد کرد.
معمولأ توالی تولید شده از مکان ثانویه اتصال پرایمر ضعیف‌تر از تولای اصلی است، از این رو باندهای غیر مستعمل (مرده) در اتورادیوگرافی به دست می‌آید. بعضی مواقع این باندهای مرده به قدری ضعیف هستند که توالی واقعی بدون زحمت قابل خواندن خواهد بود، اما در صورت باید از آن اجتناب شود.

2ـ2ـ روش های جایگزین روش پایان دهی ـ برچسب دار
روش پایان دهی ـ برچسب دار بهترین انتخاب برای توالی یابی یک الگو DNA تک رشته ای با یک آنزیم با قدرت عمل بالا نظیر سکوناز می‌باشد. در عین حال روش های دیگر توالی یابی پایان دهی زنجیره نیز وجود دارد که ممکن است در برخی موارد استفاده شوند. سه مورد از این روش ها به شرح ذیل می‌باشند.
2ـ2ـ1ـ روش دنباله ـ پایان دهی (Termination – chase) با پلی مراز کلنو
قبل از این که آنزیم های سکوناز قابل دسترس باشند؛ توالی پایان دهی زنجیره با پلی مراز کلنو انجام می‌گیرد. این آنزیم قدرت عمل نسبتاً پایینی داشت و در بهترین حالت در یک آزمایش، 200 تا 300 جفت باز را بلافاصله بعد از مکان اتصال پرایمر توالی یابی می نمود. روش دنباله پایان دهی نیز مانند روش های گسترش ـ برچسب دار (Labelling -extension ) و نوکلئوتید برچسب دار رادیو اکتیو می باشد و تنها تفاوت‌هایی در واکنش های سنتز رشته دیده می‌شود. دوابره چهار واکنش به طور موازی انجام می‌گردد اما در این حالت   ddNTPsاز شروع واکنش وجود دارند. مرحله برچسب دار کردن ابتدایی با dNTPs وجود ندارد؛ بلکه برچسب دار کردن و پایان دهی زنجیره در یک مخلوط واکنش اتفاق می افتد. بعد از نخستین پرورش dNTP های اضافی به منظور ادامه واکنش اضافه می‌گردند. به نظر می‌رسد که هریک از رشته‌هایی که با ddNTP پایان نیافته‌اند؛ اکنون تا حد امکان گسترش می‌یابند و اندازه های بزرگ تر از 300 جفت باز را ایجاد می‌کنند. بنابراین تمامی مولکول های کمتر از 300 جفت باز در ژل توالی یابی، به واسطه وجود ddNTP پایان یافته‌اند تا به واسطه تمام شدن dNTP ها. مولکول های متوقف شده باندهای شبه مانندی را در ژل پلی اکریل آمید تولید می‌نمایند و خواندن توالی‌یابی را مشکل می‌سازند.
با روش دنباله ـ پایان دهی فرصت کمتری برای هماهنگ نمودن شرایط واکنش جهت حصول نیازهای مخصوص وجود دارد. این روش تنها می‌تواند 300 جفت باز توالی نزدیک به اتصال پرایمر را مشخص نماید. با وجود این اغلب جایگزین مناسبی نسبت به روش گسترش برچسب‌دار جهت توالی یابی مکان خیلی نزدیک به محل اتصال پرایمر می‌باشد.
2ـ2ـ2ـ توالی یابی الگوهای DNA دو رشته‌ای
همچنان که ذکر گردید؛ ‌روش های پیچیده‌ای برای توالی یابی DNA تک رشته‌ای، از طریق توالی یابی پایان دهی زنجیره، مورد نیاز می‌باشد. ممکن است از خودتان سؤال کنید آیا می‌توان از این روش ها با استفاده نمودن از DNA دو رشته‌ای (به عنوان الگو) اجتناب نمود؟ در حقیقت اگر بتوانیم DNA دو رشته‌ای را توالی یابی کنیم؛ پس نیازی به کلون کردن DNA در ناقل های M13 و فاژمید نخواهیم داشت و به جای آن قادر خواهیم بود به راحتی از پلاسمید یا سیستم‌های باکتریوفاژ لاندا استفاده کنیم. اگر چه توالی یابی DNA دو رشته‌ای جای تقدیر زیاد دارد و تلاش های زیادی جهت توسعه این روش انجام گرفته است؛ اما حتی امروزه نتایج توالی یابی دو رشته‌ای قابل مقایسه با روش های تک رشته‌ای نیستند. خواندن توالی‌های تولید شده از DNA دو رشته‌ای مشکل می‌باشد و همچنین توالی‌یابی بیش از 200 جفت باز به ندرت امکان پذیر می‌باشد. مشکل اصلی در این جا کیفیت DNA تهیه شده می‌باشد، ذرات فاژی M13 ، DNA خیلی مناسبی را فراهم می‌نمایند. چنان چه کشت آلوده به درستی رشد کرده باشد؛ آلودگی سلولی مقدار کمی از سوسپانسیون فاژی به عنوان مواد شروع کننده وجود خواهد داشت. جهت به دست آوردن DNA الگوی خالص باید پوشش پروتئین فاژی را حذف نمود. برخلاف این، تهیه DNA پلاسمید با شکستن و باز شدن سلول های باکتریایی میزبان درگیر است و از لاندا DNA زمانی به عنوان مواد شروع کننده یک کشت استفاده می‌شود که در آن توده‌ای از باکتری‌های به وسیله باکتریوفاژلیز شده باشند.
در هردو مورد شما با مخلوط‌های بسیار پیچیده‌ای جهت خالص سازی الگو روبرو هستید. همچنین حذف تمام آلوده کننده‌ها کار بسیار مشکلی خواهد بود. پلی مراز کلنو به آلودگی بسیار حساس می‌باشد. از اینرو هرگز نباید با یک الگو دو رشته‌ای استفاده گردد. در حالی که پلی مراز سکوناز کمتر حساس می‌باشد و می‌تواند توالی‌های کوچکی از DNA دو رشته‌ای را تولید نماید. اما باید مطمئن شوید که DNA الگو کاملأ خالص است. به عنوان مثال الوده کننده‌های RNA می‌توانند به الگو DNA چسبیده و باعث شروع واکنش های سنتز رشته گردند، به این طریق خواندن توالی در ژل پلی اکریل آمید دچار مشکل خواهد شد. در استفاده از پلاسمیدها باید خالص سازی کامل با کلرید سزیم در مرحله شیب دانسیته (Debsuty gradient step) انجام گیرد، یا اگر از یک مینی پرپ استفاده می‌کنید، باید دقت کنید که RNA  باقی ماند به وسیله هضم ریبونوکلئازی (Ribonuclease digestion) یا رسوب کلرید لیتیم (Kutium chloride precipitaiton) حذف گردد.
هنگامی که الگو دو رشته‌ای بسیار خالص را تهیه کردید شما می‌توانید روش پایان دهی برچسب دار استاندارد را، جهت به دست آوردن یک توالی، ادامه دهید. البته باید قبل از اتصال پرایمر، DNA دو رشته‌ای به طور کامل دناتوره شود. این عمل با تیمار کردن با ماده قلیایی (Alkali) یا جوشاندن (Boiling) به دست می‌آید. به طوری که جفت بازهای میان دو رشته شکسته شده و نواحی تک رشته‌ای مناسب برای اتصال پرایمر را فراهم می‌سازد.

2ـ2ـ3ـ توالی یابی سیکل حرارتی (Thermal cycle sequencing)
توالی یابی حرارتی یک روشی است که از آنزیم‌های مقاوم در برابر حرارت نظیر DNA پلی مراز Taq در روشی که برای توالی یابی قطعات DNA به وسیله تکثیر PCR طراحی شده استفاده می‌کند. در حقیقت به دست آوردن الگوی تک رشته‌ای برای توالی یابی پایان دهی زنجیره از طریق تولیدات PCR وقت‌گیر می‌باشد. اما در استفاده از روش توالی‌یابی سیکل حرارتی که قادر به توالی یابی تولیدات PCR به طور مستقیم می‌باشد این مشکل حل خواهد گردید. روش توالی یابی سیکل حرارتی شامل مراحل زیر می‌باشد:
بعد از نخستین آزمایش PCR، پرایمرهای باقی مانده از DNA تکثیر شده را به وسیله کروماتوگرافی ستونی حذف نمایید. سپس بخشی از DNA تکثیر شده را به عنوان مواد شروع کننده جهت تکثیر دوم استفاده کنید، اما در این زمان شما فقط یکی از دو پرایمرهای PCR را به همراه ddNTP ها در واکنش استفاده نمائید. در طول مدت سیکل حرارتی، پلی مراز مقاوم به حرارت یک رشته از DNA تکثیر شده را به عنوان الگو جهت توالی یابی مورد تیمار قرار می‌دهد و مولکول های پایان دهی زنجیره سنتز می‌شوند تا الگوی باندی مورد نیاز در ژل توالی‌یابی فراهم شود. می‌توانید از یک نوکلئوتید برچسب‌دار در واکنش استفاده کنید اما معمولأ نتایج بهتری در استفاده از پرایمرهای با انتهای برچسب دار به دست می‌آید. از آنجائیکه حذف کامل پرایمرها از نخستین PCR مشکل می‌باشد، از اینرو برخی مولکول های پایان دهی زنجیره توالی رشته دومی که تولید شده است را نشان می‌دهند.
اگر پرایمر توالی‌یاب در انتها برچسب‌دار باشد، مولکول های ناخواسته در اتورادیوگرافی قابل رؤیت نخواهند بود و می‌توان از آنها صرفنظر کرد. چنانچه نخستین PCRشما محصول تک رشته‌ای تولید نماید، توالی سیکل حرارتی به خوبی کار خواهد کرد. در این حالت هنگامی که نتایج در ژل آگارز تجریه گردد، فقط یک باند مشاهده می‌شود. اگر PCR باندهای اضافی تولید نماید پس باید محصول PCR مودر نظر از ژل آگارز قبل از انجام واکنش های توالی یابی خالص گردد. روش سیکل حرارتی همچنین جهت توالی یابی مقادیر کوچکی از پلاسمید دو رشته‌ای و الگوهای لاندا (به طور مثال از یک کلونی یا پلاک) استفاده می‌شود، اما مانند توالی یابی DNA دو رشته‌ای باید DNA آنها کاملأ از مواد آلوده کننده مبرا باشد.
توالی یابی پایان دهی زنجیره (ران کردن ژل و خواندن توالی)
در پایان واکنش های سنتز رشته چهار خانواده از مولکول های پایان دهی به دست می‌آید. در یک خانواده همه مولکول ها به A ختم می‌شوند. در دیگری به C، در سومی به G و در چهارمین خانواده به T ختم می‌گردند.
شما اکنون باید این مولکول ها را در یک ژل پلی اکریل آمید به منظور به دست آوردن الگوی باندی و در نتیجه توالی یابی DNA جدا نمایید. انجام این کار شامل مراحل زیر می‌باشد:
1ـ الکتروفورز ژل (بخش 1): تهیه ژل پلی اکریل آمید، لود کردن نمونه‌ها، ران کردن ژل و به دست آوردن اتورادیوگراف (فرض کنید که از یک برچسب رادیواکتیو استفاده کرده‌اید)
2ـ خواندن توالی (بخش2): تفسیر الگوی باندی در اتورادیوگرافی
3ـ آنالیز توالی (بخش 3): استفاده از توالی‌های انفرادی به دست آمده از آزمایشات مختلف جهت تهیه یک توالی عظیم پیوسته (Contiguous master sequence)، شناسایی چهارچوبهای خواندن باز (ORFs) (Open reading frames) و دیگر موتیف‌های ژنتیکی (Genetic Motifs)، و بررسی اطلاعات پایه (بانک‌های اطلاعاتی) (Detabases) مرتبط با توالی‌ها این فصل شما را با این سه مرحله آشنا می‌سازد.

ژل توالی یابی
اگر برای اولین بار ژل می‌ریزید؛ در استفاده از ژل های توالی یاب، به طور حتم با مشکلات زیادی مواجه خواهید شد و ممکن است سختی قبول کنید که ژل های توالی یابی کم و بیش آخرین تکنولوژی مرسوم الکتروفورز ژل را نمایش می‌دهند. برای اینکه توالی‌یابی موفقیت آمیز باشد؛ باید امکان جداسازی مولکول های DNA با اندازه های متفاوت (حتی با تفاوت یک نوکلئوتید) وجود داشته باشد. در استفاده از خانواده‌های مولکول های پایان دهی زنجیره جهت توالی یابی الگو، این مورد اهمیت زیادی دارد. جداسازی یک مولکول DNA مثلا با 147 نوکلئوتید از مولکول دیگر با 146 یا 148 نوکلئوتید آسان نیست؛ اما از طریق استفاده از الکتروفورژل های پلی آکریل آمید با وضوح بسیار بالا امکان پذیر می‌باشد. در بخش های بعدی این موضوع شرح داده خواهد شد.
1ـ1ـ طی عمل الکتروفورز ژل چه اتفاقی رخ می‌دهد؟
مولکول های DNA مانند پروتئین‌ها و بسیاری از ترکیبات بیولوژی دیگر دارای بار الکتریکی می‌باشند (بار DNA منفی می‌باشد). این بدان مفهوم است که وقتی مولکول های DNA در یک میدان الکتریکی (Electric field) قرار می‌گیرند به سمت قطب مثبت حرکت می‌نمایند. این فرآیند الکتروفورز نامیده می‌شود. روش های مرسوم الکتروفورز در فار محلول (Solution phase) انجام می‌شوند. تحت این شرایط میزان حرکت یک مولکول به دو عامل شکل و نسبت بار به جرم مولکول ها وابسته می‌باشد. از آنجایی که شکل (معمولاً خطی) و نسبت بار به جرم بیشتر مولکول های DNA یکسان می باشد؛ از این رو مولکول های DNA با طول های متفاوت نمی‌توانند به طور مؤثر توسط روش های مرسوم الکتروفورز جدا شوند. با وجود این اگر الکتروفورز در یک ژل آگارز یا پلی اکریل آمید انجام گیرد؛ طول مولکول DNA یک عامل مهم در الکترو فورز محسوب می‌شود. یک ژل، متشکل از شبکه پیچیده‌ای از منافذ می‌باشد که مولکول های DNA جهت رسیدن به الکترود مثبت از آن باید عبور نمایند. مولکول های کوتاه تر DNA سریع تر از منافذ ژل عبور کرده و به سمت قطب مثبت حرکت می‌نمایند. از این رو الکتروفورز ژل، مولکول های DNA را بر حسب طول آنها جدا می‌سازد. وضوح و اندازه مولکول هایی که جدا می‌شوند وابسته به اندازه منافذ ژل می‌باشند. جهت توالی یابی نیاز به تفکیک در حد یک نوکلئوتید و همچنین نیاز به جداسازی مولکول های با طول حدود 20 تا 1000 نوکلئوتید می‌باشد. این کار با ژل آگارز امکان پذیر نیست. چون منافذ آن خیلی بزرگ می‌باشند. از این رو شما مجبورید که از ژل پلی اکریل آمید استفاده کنید.
وابسته بودن حرکت مولکول DNA به شکل آن، دلیل مشکل ساز بودن ساختاری حلقه سنجاق سری می‌باشد.
1ـ2ـ چگونه ژل پلی اکریل آمید را به کار می‌برید؟
ژل های پلی اکریل آمید با پلی مریزه شدن (Polymerizatio) مونومرهای اکریل آمید در زنجیره‌های طولانی و اتصال از طریق واحدهای methylenebisacrylamide ـ N و N پریم تشکیل می‌شوند. اندازه منفذ (سوراخ) ژل به وسیله غلظت مونومرهای اکریل آمید در محلول پلی مریزاسیون تعیین می‌گردد (1991 Andrews) عموماً جهت توالی یابی DNA از ژل 6% استفاده می‌شود. این نوع ژل مولکول های با اندازه 500 ـ 25 نوکلئوتید را تجزیه می‌نماید. چنان چه شما مایل به خواندن یک توالی خیلی نزدیک به پرایمر باشید؛ باید غلظت ژل را به 8% افزایش دهید. همچنین اگر قصد دارید که یک توالی با بیش از 500 نوکلئوتید را گسترش دهید؛ باید غلظت ژل را به 5 یا حتی 4% کاهش دهید.

لودکردن نمونه‌ها
هنگامی که در نوشته های قبلی واکنش های سنتز رشته را به حال خود باقی گذاشتیم؛ فقط مخلوط رنگی فورمامید را به هر نمونه اضافه کردیم. قبل از این که نمونه‌ها را لود کنید؛ باید واکنش ها را در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه پرورش دهید تا مولکول های پایان دهی زنجیره از DNA الگو جدا شوند. سپس نمونه‌ها را در یخ قرار داده و 2 تا 4 میکرولیتر از هر واکنش را در چاهک‌ها به دقت لود کنید. این کار چندان هم آسان نیست. فاصله بین صفحات کمتر از نیم میلی‌متر می‌باشد. از این رو یک پیپت نوک دار معمولی برای داخل کردن در چاهک ها مناسب نیست. چهار روش برای انجام این کار وجود دارد:
1)   استفاده از یک پیپت نوک‌دار مخصوص با انتهای کشیده
2)   استفاده از یک لوله مویی کشیده (Capillary tube)
3)   استفاده از سرنگ 30 یا سرنگ باریک تر
4)   استفاده از یک پیپت نوک‌دار معمولی که به وسیله آن نمونه به طور عمودی به داخل چاهک چکانده شود.
روش آخر، بهترین روش است زیرا خسارت های وارد شده به چاهک را در مدت لود کردن کاهش می‌دهد. در لود کردن هیچ وقت نباید عجله کنید؛ اما سعی کنید که لود کردن در 2 دقیقه تمام شود. ترتیب لود کردن نمونه‌ها مهم نیست؛ اگرچه ترتیب الفبایی (A-C-G-T) عمومی‌ترین حالت است؛ اما ممکن است شما آن را تغییر دهید. اگر DNA الگوی شما دارای مقادیر بالای AT یا غنی از GC باشد؛ ترتیب A-T-G-C بهتر خواهد بود زیرا دو مسیر با اکثریت باندها (T و A یا C و G) در کنار همدیگر خواهند بود.
ران کردن ژل
به محض این که آخرین نمونه را لود کردید؛ دستگاه را به منبع جریان (Power supply) وصل کنید و آن را روشن نمایید. محل استقرار دستگاهی که استفاده می‌کنید به ابعاد (Dimensions) ژل بستگی دارد. توجه داشته باشید که ولتاژ دستگاه بسیار بالا می‌باشد و می‌تواند فرد را در جا بکشد!!! از این رو هرگز با دستگاهی که روشن است بازی نکنید و از دستگاهی که مخزن آن نشت دارد استفاده نکنید. ولتاژ مناسب 45 ولت بر سانتی متر می‌باشد.
شما می‌توانید پیشرفت الکتروفورزی را با مشاهده مهاجرت (حرکت) دو رنگ برومو فنول آبی و سیانول گزیلن در پایان ژل دنبال کنید. میزان حرکت این رنگ ها بستگی به غلظت اکریل آمید در ژل دارد. در یک ژل 6%، رنگ آبی بروموفنول (رنگی که سریعتر حرکت می‌کند) به میزان یکسانی مانند یک مولکول DNA تک رشته‌ای که 25 نوکلئوتید طول دارد حرکت می‌نماید. در این ژل سیانول گزیلن مانند یک مولکول 100 نوکلئوتیدی حرکت می‌نماید. بنابراین شما می‌توانید طولی از ران شدن (جهت توالی یابی) که مورد نظرتان است را مشخص نمایید. اگر شما بخواهید توالی نزدیک به پرایمر را بخوانید؛ پس هنگامی که بروموفنول به فاصله چند سانتی متری از پایین ژل می‌رسد الکتروفورز را متوقف کنید؛ که معمولاً این حالت نزدیک به 2 ساعت وقت می‌برد. اگر بخواهید توالی دور از پرایمر را بخوانید؛ ژل را برای مدت طولانی‌تری ران کنید. اگر چاهک هایی را یدک نگه داشته‌اید؛ می‌‌توانید در یک نقطه مشخص الکتروفورز را متوقف نمایید و سپس قسمت دوم هر یک از نمونه‌ها را لود کنید و دوباره دستگاه را روشن کنید. در این حالت یک ران بلند مدت و کوتاه مدت از همان توالی به دست می‌آید.
برخی پروتکل‌ها توصیه می‌نمایند که قبل از لود کردن، ژل را باید با یک پیش الکتروفورز (در همان ولتاژی که برای الکتروفورز استفاده می‌شود)، برای مدت 30 دقیقه یا بیشتر گرم نمود
3ـ واکنش های قطع شیمیایی
وقتی DNA را تهیه کردید؛ می‌توانید آن را در واکنش های قطع شیمیایی استفاده نمایید و خانواده‌هایی از مولکول های شکسته شده را به دست آورید تا بعداً در ژل توالی‌یابی لود گردند. واکنش های قطع شیمیایی در دو مرحله انجام می‌شوند. نخست DNA با یک ماده شیمیایی که یک باز نوکلئوتید را تغییر می‌دهد تیمار می‌گردد. سپس پی پریدین اضافه می‌شود تا DNA را در مکان تغییر یافته برش دهد. این دو مرحله به طور کامل توضیح داده می‌شود.
3ـ1ـ واکنش های تغییر نوکلئوتید
چنانچه روش توالی یابی معمولی را دنبال می‌کنید؛ DNA را به چهار قسمت تقسیم نموده و لوله‌هایی را به شرح ذیل تیمار نمایید:
لوله 1: دی متیل سولفات اضافه کنید (واکنش G).
لوله 2: اسید فرمیک اضافه کنید (واکنش A+G).
لوله 3: هیدرازین اضافه کنید (واکنش C+T)
لوله 4: NaCl به همراه هیدرازین اضافه کنید (واکنش C).
هنگامی که تصمیم گرفتید که چه مقدار DNA استفاده کنید؛ عامل مهم میزان برچسب‌دار کردن خواهد بود. دو نمونه از واکنش ها به طور کامل مختص یک باز نیستند. ثابت شده است که طراحی واکنش های که هر باز را به صورت انفرادی تشخیص بدهند غیر ممکن می‌باشد. از این رو در این روش دو مورد از واکنش ها فامیل‌های مخلوط شده‌ای از مولکول ها، شامل یک خانواده A+G و یک خانواده C+T را به وجود می‌آورند. معمولاً این حالت، در خواندن ژل توالی یابی هیچ مشکلی ایجاد نمی‌کند. اگر بخواهید می‌توانید واکنش پنجم را نیز انجام دهید (با NaOH به همراه EDTA جدول 1ـ5) که در آن در نوکلئوتیدهای A و C شکسته می‌شود. البته با ارجحیت نهادن به نوکلئوتیدهای A این واکنش A>C برای شما یک مسیر پنجم را در ژل توالی یابی فراهم می‌نماید و کمک می‌نماید تا هرگونه آشفتگی در ژل واضح گردد. البته اکثر اوقات این واکنش اضافی نیاز نمی باشد.
روش استاندارد عمومی‌ترین روش قطع شیمیایی است، البته در چند سال گذشته تغییراتی نیز در این روش ایجاد شده است (1987 Ambrose and Pless) به عنوان مثال یکی از اهداف، جایگزینی مواد شیمیایی کم خطرتر به جای مواد شیمیایی خطرناک بوده است. اما روش استاندارد هنوز به طور گسترده استفاده می‌شود. هر تغییری بعد از چند دقیقه در دمای 25 درجه سانتی گراد کامل می‌شود. از این رو با اضافه کردن یک بافر استات (Acetate buffer) (فرمول دقیق آن به واکنش بستگی دارد) واکنش متوقف می‌شود و DNA با رسوب کردن اتانول بازیافت می‌گردد. اکنون همه چیز جهت انجام مرحله دوم آماده می‌باشد.
جدول 1ـ5ـ واکنش های تغییر نوکلئوتیدی مورد استفاده در توالی یابی قطع شیمیایی

معرف واکنش


دی متیل سولفات
G

اسید فورمامید
A+G

هیدارزین
C+T

NaCl + هیدرازین
C

NaOH+EDTA
A>C

NaOH
A>C تغییر یافته

پتاسیم پرمنگنات
T
3ـ2ـ شکستگی رشته
جهت ایجاد شکستگی در رشته، پلت‌های DNA مربوط به رسوب اتانول را در 1M پی‌پریدین مجددا سوسپانسیون نمائید و برای مدت 30 دقیقه در درجه حرارت 90 درجه پرورش دهید. در مدت این پرورش بازهای تغییر شکل یافته پورین و پریمیدن از پلی نوکلئوتیدها حذف می‌شوند، و هر رشته بلافاصله در بالادست موقعیت باز از دست رفته در پیوند فسفودی استرشکسته می‌شود. نکته اساسی در این مرحله این است که واکنش های شکستگی به طور کامل انجام شوند. چنانچه تعدادی از مکان های تغییر شکل یافته بدون شکستگی باقی بمانند؛ تعداد زیادی از پلی نوکلئوتید با طول کامل در مخلوط‌های واکنش وجود خواهد داشت. در این حالت مولکول های شکسته شده کمتری به دست آمده و در نتیجه باندها در اتورادیوگراف ضعیف و غیر متمایز خواهند بود. پرورش به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت 90 درجه جهت شکستگی کامل واکنش ها زمان مناسبی می‌باشد، اما باید مطمئن باشید که لوله‌ها محکم بسته شده‌اند تا پی پریدین تبخیر نشود. از دست رفتن پی پریدین ممکن است باعث انجام یک واکنش ناقص شود. بعد از پرورش دادن، پی‌پریدین با یک تبخیر کننده دوار (Rotary evaporator) حذف می‌شود و نمونه های DNA در یک بافرلود کننده (Loading buffer) مجدداً سوسپانسیون گردیده و جهت الکتروفورز در ژل توالی یابی آماده می‌شوند.
احتیاط: پی‌پریدین به راحتی شعله‌ور می‌گردد و با استنشاق و تماس با پوست سمیت ایجاد می‌کند. توجه کنید که محلول های ذخیره پی‌پریدین (معمولاً M10) بیشتر پلاستیک ها را حل می‌نمایند. از این رو نباید در بطری های پلاستیکی نگهداری شوند
استراتژی های توالی یابی کل ژنوم
روش (I  Clone By Clone
در ابتدا ژنوم به تعداد زیادی قطعات بلند تقسیم می شود. سپس کلون های بزرگ ایزوله می شوند. بعد نقشه فیزیکی را تهیه می کنیم و بعد هر قطعه را توالی یابی می کنیم.
روش (II تعیین توالی شکاری  Shotgun Sequencing
DNAیی که قرار است توالی آن مشخص شود؛ در این روش به طور تصادفی شکسته می شود و آنگاه قطعات حاصل در یک ناقل کلون می شوند. سپس از محل اتصال این قطعات به DNA ی حامل، همانند سازی در یک یا هر دو جهت آغاز می شود. فرآیند تکثیر تا زمانی که مقدار تولید شده به 5-10 برابر الگوی اولیه برسد ادامه می یابد و بعداً با استفاده از کامپیوتر، همپوشانی توالی های مختلف در این مجموعه خوانده می شود و هرچه تعداد همپوشانی بیشتر باشد؛ میزان اطمینان از صحت توالی تعیین شده بالاتر می رود. در این روش: 1) نیازی به تهیه نقشه نیست 2) کل ژنوم تقسیم می شود 3) توالی یابی به صورت تصادفی است. جمع بندی جامع اطلاعات در نهایت توسط برنامه های  Consedو Phrap,Phred صورت می گیرد.

انواع ناقل ها (VECTOR)

Size of insert (bp)
Plasmid
2,000-10,000
Can control the size

Cosmid
40,000

BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
70,000-300,000

YAC (Yeast Artificial Chromosome)
> 300,000
Not used much recently

امروزه روش های خودکار تعیین توالی، تغییر اساسی در سرعت و جهت گیری پروژه های ژنومی ایجاد کرده است.