تهیه نقشه ژن ها و ژنوم ها

نقشه یابی ژن ها و تهیه نقشه های ژنتیکی کاری اساسی در علم ژنتیک محسوب می شود. زیرا بخش عمده ای از علم ژنتیک با درک توارث صفات ویژه و دست ورزی آنها در ارتباط می باشد. به طور مثال، برای گیاهان و حیواناتی که از نظر کشاورزی و دام پروری حایز اهمیت هستند؛ این گونه اطلاعات به منظور به نژادی و شناسایی نسل های واجد صفات مطلوب به کار می رود. در مورد انسان نیز هدف، شناسایی جنین های حامل ژن های مسئول اختلالات توارثی می باشد. به عبارت دیگر، هدف، تشخیص پیش از تولد بیماری های ژنتیکی است. 

  اگر ژن مربوط به یک صفت خاص شناخته شده باشد؛ تشخیص به سهولت انجام می گیرد. اما متأسفانه ژن های تنظیم کننده بسیاری از صفات هنوز شناخته نشده اند و بنابراین متخصصین ژنتیک برای شناسایی این گونه صفات به ژن های نشانگر یا نشانگرهای مولکولی روی آورده اند. این ژن ها به راحتی قابل شناسایی بوده و به لحاظ ژنتیکی با ژن تنظیم کننده صفت مورد نظر پیوستگی دارند.

برای تعیین مکانی ژنی یک صفت، با استفاده از پیوستگی ژنتیکی مجموعه ای از نشانگرها که با آن صفت تفرق همزمان (Co-segregation) نشان می دهند؛ مورد آزمون قرار می گیرند. دو مکانی ژنی A و B وقتی پیوسته خواهند بود که آلل های هر دو مکان ژنی روی یک کروموزوم قرار داشته باشند و در تقسیم میوز با یکدیگر منتقل شوند. شرط لازم، اما غیرکافی، برای پیوسته بودن دو مکان ژنی این است که سینتنیک باشند؛ یعنی هر دو روی یک کروموزوم قرار داشته باشند. ترکیب آلل ها در مکان های ژنی پیوسته را «هاپلوتیپ» (haplotype) می گویند. برای مثال هاپلوتیپ A₁B₁ به این معنی است که روی یک کروموزوم مکانی ژن A حاوی آلل A₁ و مکان ژنی B حاوی آلل B₁ می باشد. در طی هر میوز، حداقل یک کراسینگ اور در بین کروماتیدهای غیرخواهری هر جفت کروموزوم همولوگ اتفاق می افتد. پیوستگی ژنتیکی مستلزم آن است که جایگاه های ژنی روی یک کروموزوم از نظر فیزیکی به اندازه کافی به هم نزدیک باشند. بنابراین، برای تعیین محل یک ژن جدید بر روی نقشه ژنتیک، نیاز به وجود تعداد زیادی نشانگر مختلف در طول هر کروموزوم است که در بهترین حالت باید در فواصل یکنواخت نسبت به یکدیگر قرار گرفته باشند. در میکرو ارگانیسم هایی مثل اشرشیاکلی و مخمر، این نشانگرها را می توان به راحتی از طریق جهش های کلاسیک به وجود آورد. هرچه موجودات تکامل یافته تر می شوند؛ تولید چنین نشانگرهایی نیز مشکل تر می شود. در انسان انجام چنین کاری از نظر اخلاقی غیرقابل قبول است. در عوض، می توان از چندشکلی (Polymorphism) طبیعی موجود در جوامع انسانی به عنوان نشانگر استفاده کرد.

طبق تعریف، کلیه چندشکلی ها در سطح DNA به وجود می آیند. متأسفانه برخلاف صفات مندلی، تنها تعداد کمی از این چند شکلی ها قابل امتیازدهی هستند. پیشرفت های حاصله در فناوری DNA نوترکیب و از جمله کاربرد کاوشگرهای DNA برای تعیین چند شکلی در توالی های DNA منجر به شناسایی تعداد زیادی مکان ژنی نشانگر شده است. برای اولین بار، این چند شکلی ها با مشاهده ی تفاوت طول قطعات حاصل از هضم آنزیمی به وسیله ی اندونوکلئازهای محدودگر (RFLP) تشخیص داده شدند. اندونوکلئازهای به کار گرفته شده در این مطالعه، توالی های خاص DNA را برش می دهند.

برای ایجاد یک نقشه RFLP ، کاوشگرها باید بتوانند اطلاعات زیادی را فراهم آورند. این بدان معنی است که مکان ژنی موردنظر نه تنها باید دارای چندشکلی باشد؛ بلکه میزان این چندشکلی نیز باید بسیار زیاد باشد. اگر تعداد افراد مورد مطالعه کافی باشد؛ هر کاوشگر که به طور تصادفی انتخاب گردد؛ نهایتاً قادر به نشان دادن چند شکلی خواهد بود. با این وجود، اگر یک آلل در 9/99 درصد افراد یک جمعیت و آلل دیگر تنها در 1/0 درصد افراد آن جمعیت مشاهده گردد؛ این نوع چند شکلی کارایی چندانی نخواهد داشت؛ زیرا در چنین حالتی به ندرت می توان به اطلاعات کافی و مناسب دست یافت. بنابراین به عنوان یک قانون کلی، نشانگرهای RFLP که برای تهیه نقشه ژنتیک به کار می روند؛ باید دارای دو یا سه آلل با فراوانی معادل باشند.

اولین نقشه RFLP برای ژنوم کامل انسان توسط دونیس کلر و همکاران (1987) تشریح شد. آن ها برای بررسی RFLPها، DNA استخراج شده از 5 فرد غیر خویشاوند را به طور جداگانه با 6 تا 9 آنزیم محدودگر هضم نمودند؛ سپس با استفاده از 1680 کلون مربوط به یک کتابخانه ژنومی انسان (به عنوان کاوشگر)، چند شکلی های موجود در DNA این افراد را به روش لکه گذاری سادرن بررسی نمودند. در نتیجه، آن ها بیش از 500 کاوشگر را شناسایی کردند که قادر به نشان دادن الگوهای نواربندی متفاوتی بین افراد (که بیانگر چند شکلی است) بود. از این مجموعه تعداد 180 کاوشگر که بیشترین درجه چند شکلی را نشان می دادند برای مطالعه نحوه ی توارث پذیری در 21 خانواده CEPH انتخاب گردیدند. کاوشگرهای دیگری نیز از کتابخانه های خاص هر کروموزوم انتخاب گردید. به طوری که نهایتاً 393 نشانگر RFLP انتخاب شد.

با تجزیه تحلیل ریاضی پیوستگی ژنتیکی و موقعیت فیزیکی کلون های انتخاب شده، مکان های ژنی مختلف در گروه های پیوستگی مرتب شدند که نشان دهنده ی 23 کروموزوم انسان بودند. برای تعیین موقعیت فیزیکی هر کلون، کاوشگر مربوطه با مجموعه ای از سلول های هیبرید انسان – موش (که هر مجموعه سلولی دربرگیرنده ترکیب کروموزومی مختلفی از مجموعه کروموزومی انسان بودند) دو رگ گردید.

نقشه های RFLP تنها مربوط به ژنوم انسان نیستند. برای مثال نقشه های RFLP بسیاری از گیاهان زراعی مهم منتشر گردیده است.

نقشه ژنوم انسان که توسط دونیس کلر و همکاران وی (1987) تهیه گردیده، یک مثال مشخص و مشهور است. با این وجود، در این نقشه متوسط فاصله بین مکان های ژنی نشانگرهای RFLP در حدود 10 سانتی مورگان (cM) بود. یعنی مکان های ژنی ده درصد شانس نوترکیبی در تقسیم میوز داشتند. اگر فرض کنیم که ژنوم انسان در حدود 4000 سانتی مورگان طول داشته باشد؛ فاصله بین مکان های ژنی به طور متوسط Mb 10 خواهد بود. این فاصله، برای جداسازی یک ژن معین خیلی زیاد است. به هر حال، چنان چه از روش دونیس کلر و همکاران (1987) برای ساختن یک نقشه با فاصله های cM1 استفاده شودغ حجم کار 100 برابر خواهد شد.

زیرا در این صورت تعداد کاوشگرهای مورد نیاز 10 برابر بیشتر از حالت قبل خواهد بود و ضمناً تعداد فامیل های مورد مطالعه نیز باید 10 برابر افزایش یابند. راه حل مناسب برای رفع این مشکل، استفاده از نشانگرهای چند شکل دیگر و سایر روش های تهیه نقشه است که می توانند اطلاعات زیادتری تولید نمایند. استفاده از چنین روش هایی در انسان منجر به تولید نقشه ای شده است که در آن فاصله نشانگرها از یکدیگر به طور متوسط cM7/0 است. در نقشه مربوط به موش نشانگرها به فاصله متوسط cM2/0 از یکدیگر قرار دارند. مهم تر این که پیشرفت های اخیر در نقشه یابی ژن ها محققین را به سوی تکمیل نقشه های ژنتیکی نمونه برای بسیاری از گیاهان زراعی و حیوانات اهلی هدایت کرده است.

نکته قابل توجه این است که تهیه نقشه ژنوم انسان نسبت به سایر گیاهان و حیوانات با مشکلات بسیار بیشتری روبروست. زیرا از یک طرف انجام آمیزش های تنظیم شده به دلایل اخلاقی امکان پذیر نیست و از طرف دیگر طول یک دوره به نژادی در انسان زیاد است (حداقل 15- 16 سال) و این موضوع کاربرد روش های رایج را برای تجزیه و تحلیل ژنوم غیرممکن می سازد. به همین خاطر در سال 1984 سازمانی به نام CEPH در پاریس تأسیس گردید. در این مرکز لاین های سلولی دو نسل از هر فامیل انسان شامل چهار والد اجدادی، دو والد و به طور متوسط 8 فرزند نگهداری می شوند. در بدو امر لاین های سلولی 40 فامیل نگهداری می شدند ولی هم اکنون این تعداد افزایش یافته است. این فامیل ها برای تهیه نقشه های ژنتیکی بسیار ارزشمند هستند؛ زیرا به راحتی می توان دریافت که یک آلل مشخص از کدام والد به ارث رسیده است. سازمان CEPH ، DNA این خانواده ها را در اختیار کلیه محققین در سراسر جهان قرار می دهد.

نقشه یابی مقایسه ای ژنوم

پیشرفت های اخیر در نقشه یابی ژن ها منجر به کامل تر شدن نقشه های ژنتیکی مدل در بسیاری از گونه ها شده است. در ابتدا، این نقشه ها به منظور فراهم کردن منابعی برای تجزیه و تحلیل ژنتیکی در گونه های خاص ایجاد شدند. اخیراً با استفاده از این نقشه ها مشخص شده که نه تنها در بین گونه های نزدیک به هم (مانند غلات) بلکه حتی بین گونه های دور از هم (مثلاً بین انسان و ماهی پافر) نیز ترتیب ژن ها تا حد زیادی حفظ شده است. این پدیده دارای دو مزیت می باشد:

اول این که انتقال یافته های پیوستگی ژنی از گونه واجد نقشه غنی به گونه فاقد نقشه غنی را امکان پذیر می سازد و بدین ترتیب سرعت تشکیل نقشه ژنومی را افزایش می دهد. همگام با گسترش نقشه یابی ژن ها ، میزان اطلاعات به طور نمایی افزایش می یابد.

مزیت دوم این است که مقایسه نقشه ها به درک چگونگی تکامل سازمان ژنومی کمک نموده و سرنخ هایی را درباره منطق سازگاری (در صورت وجود) نهفته در آرایش های ساختاری ویژه در ژنوم فراهم می کند.

تجزیه و تحلیل گونه زدایی گل های میمون مثال خوبی است که نشان می دهد چگونه نقشه های مولکولی به فهم فرآیندهای تکاملی کمک می کند. دو گونه میمولوس که از نظر ژنتیکی جدا هستند (به علت متفاوت بودن پرندگان گرده افشان آن ها)، یافت شده اند که در 8 خصوصیت ریخت شناختی با یکدیگر تفاوت دارند. از آنجا که این سازواره ها فاقد نقشه ژنتیکی مفصل می باشند؛ نقشه ای با استفاده از نشانگرهای DNA برای آن ها تهیه شد. وقتی تجزیه و تحلیل با استفاده از نشانگرهای مولکولی صورت گرفت؛ هریک از این خصوصیت های متفاوت حداقل با یک ژن بزرگ اثر مرتبط گردید. این گونه مطالعات در نهایت یکی از قدیمی ترین مجادلات را در ژنتیک روشن می کند. آیا سازگاری ها تقریباً همیشه مبتنی بر تعداد بسیار زیادی جهش (هر یک با اثر کم) هستند؛ یا ناشی از تغییرات منفرد با اثرات بزرگ می باشند. ابداع نشانگرهای DNA باعث شده است که امروزه تجزیه و تحلیل ژنتیکی گونه زدایی و سازگاری را بتوان به هر گونه دلخواه تعمیم داد و دیگر محدود به گونه هایی نباشیم که به طور مفصل در آزمایشگاه مطالعه شده اند.

انواع نقشه های قابل تهیه

به طور کلی نقشه های قابل تهیه از روی ژنوم موجودات زنده به سه گروه کلی قابل طبقه بندی است:

1. نقشه های سیتوژنتیکی

نقشه های سیتوژنتیکی Cytogenetic maps به کمک نشانگرهای مورفولوژیکی در موجودات مختلف تهیه می شوند و امروزه با روی کار آمدن نشانگرهای مولکولی و ژنومی (DNA) روش های جدیدی برای تهیه این نقشه ها به دست آمده است که استفاده از آنیوپلوئیدها، نشانگرهای خاص و دورگ گیری پرتوتاب را می توان نام برد.

2. نقشه های فیزیکی

نقشه های فیزیکی جایگاه ژن ها را در طول یک کروموزوم نشان می دهند. فواصل بر حسب مگازوج باز (Mbp)  بیان می گردد و با فراوانی نوترکیبی تناسبی ندارد. این نقشه ها با استفاده از سلول های سومایی و با روش های مختلفی در آزمایشگاه قابل تهیه هستند که می توان به روش دو رگ گیری در محل، روش کروموزوم ساختگی مخمر و باکتری و غیره اشاره کرد. که در ادامه به طور کامل شرح داده خواهد شد.

3. نقشه های ژنتیکی

نقشه های ژنتیکی در یک گونه نباتی یا حیوانی، ترتیب خطی گروهی از ژن ها و نشانگرها را به صورت مدل خلاصه ای نمایش می دهند. در واقع یک نقشه پیوستگی ژنتیکی ترتیب قرار گرفتن تعداد زیادی جایگاه ژنی شامل نشانگرهای مورفولوژیکی، ایزوزایمی، پروتئینی و نشانگرهای DNA در طول کروموزوم را نشان می دهد. فاصله بین این جایگاه های ژنی با سانتی مورگان (cM) نشان داده می شود که بیانگر مقدار نوترکیبی بین جایگاه های ژنی است.

باید توجه داشت که ارتباط خاصی بین فاصله نوترکیبی (برحسب سانتی مورگان) با فاصله فیزیکی (برحسب جفت باز) وجود ندارد زیرا مقدار نوترکیبی در طول کروموزوم تغییر می کند.

ژن به طور کلاسیک عامل مندلی یا قطعه ای DNA است که توسط یک عملکرد شناخته شده یا به منظور یک آزمون بیوشیمیایی تشخیص داده شده در نظر گرفته شود. نشانگر می تواند یک نشانگر سیتولوژیکی، متغیری براساس تغییر در یک ژن یا پروتئین شناخته شده یا اساساً قطعه ای DNA بدون عمل مشخص باشد. هر دوی ژن و نشانگر باید توارث ساده ای داشته باشند که بتواند در طی نسل ها دنبال شود. یک ژن با فعالیت شناخته شده اگر حاوی تنوع قابل ردیابی باشد؛ می تواند نشانگر در نظر گرفته شود.

یک نقشه ژنتیکی براساس نوترکیبی بین کروموزوم های همولوگ در طی تقسیم میوز تهیه می شود؛  لذا یک نقشه ژنتیکی یک نقشه میوزی نیز نامیده می شود. اگر دو یا چند نشانگر در نزدیک یکدیگر در یک کروموزوم قرار گرفته باشند؛ آلل های آنها معمولاً با یکدیگر از طریق میوز توارث می یابند.

مراحل اساسی در تهیه نقشه ژنتیکی

1.                انتخاب مناسب ترین جمعیت ها برای تهیه نقشه ژنتیکی

2.                محاسبه فراوانی نوترکیبی بین هر جفت از نشانگرها در جمعیت های مورد بررسی

3.                ایجاد ترتیب خطی با یک مقیاس مناسب فاصله ای برای نشانگرها

4.                ایجاد گروه های پیوستگی و برآورد فواصل نقشه

5.                تعیین ترتیب اجزا موجود روی نقشه

6.       ارتباط نقش های ژنتیکی بدست آمده به کروموزوم های مشخصی که مشکل ترین قسمت همین بخش می باشد که از لحاظ اصلاح نباتات چندان ضروری نمی باشد.

نقشه های فیزیکی ژنوم

پس از این که یک ژنوم قطعه قطعه گردید و کلون شد؛ و این قطعات برای تولید کتابخانه ژنومی انجام گرفت؛ لازم است قطعات مزبور به همان ترتیبی که در کروموزوم اولیه داشته اند؛ مرتب شده و به صورت خطی کنار یکدیگر قرار گیرند. تعیین موقعیت این قطعات کلون شده، مشابه کامل کردن یک صفحه جورچین است؛ با این تفاوت که به جای قطعات جور شونده، در بین کلون ها، توالی های هم پوشان مشخصی وجود دارند. چون تعداد قطعات خیلی زیاد است؛ وجود یک روش تشخیص سریع برای شناسایی کلون های هم پوشان موردنیاز است. چنانچه توالی هر کلون به طور کامل مشخص شود؛ نقاط هم پوشانی که در جای دیگری از ژنوم تکرار نشده باشند نیز به راحتی شناسایی خواهند شد. اما با فناوری رایج توالی یابی، روش فوق عملی نیست. به عنوان مثال، برای تعیین توالی ژنوم انسان با استفاده از یک کتابخانه کاسمیدی (هر کاسمید به طور متوسط قطعه ای به طول 40 کیلو باز را در خود جای می دهد) تقریباً 10000 ژل توالی یابی مورد نیاز است.

یکی از روش های مرتب کردن و اتصال قطعات کلون شده «گام زنی کروموزومی» است (chromosom walking). این روش در ابتدا به منظور جداسازی توالی های ژنی با عمل ناشناخته اما موقعیت ژنتیکی مشخص به کار برده شد. به منظور تولید نقشه، یکی از قطعات کلون شده به عنوان کاوشگر برای شناسایی سایر کلون های کتابخانه که با آن دورگ می شود و در نتیجه با آن هم پوشان هستند؛ مورد استفاده قرار می گیرد. هم پوشانی می تواند با سمت چپ یا راست این قطعه صورت گیرد. این گام زنی یک مرحله ای را می توان به دفعات و در هر دو جهت یک کروموزوم تکرار کرد. مشکل بالقوه ای که در ارتباط با گام زنی کروموزومی وجود دارد؛ حضور توالی های تکرار شونده است. اگر کلونی که به عنوان کاوشگر مورد استفاده قرار می گیرد؛ حاوی توالی تکرار شونده ای باشد که در جای دیگری از ژنوم نیز وجود دارد؛ عمل دورگه سازی به درستی صورت نخواهد گرفت. به این دلیل کاوشگر مورد استفاده برای گام زنی باید کلون یا زیرکلونی باشد که توالی منحصر به فردی داشته باشد. واضح است که در گام زنی کروموزومی هرچه اندازه قطعات DNA مورد استفاده بزرگ تر باشد؛ تعداد مراحل نقشه یابی کم تر می شود. با وجود جذابیت گام زنی کروموزومی، این روش پرزحمت و وقت گیر است و این از ارزش آن در نقشه یابی ژنوم ها می کاهد. در صورت استفاده از کلون های کاسمیدی، حداقل 4500 «گام» برای ژنوم مگس سرکه و 70000 گام برای ژنوم انسان موردنیاز خواهد بود. در عمل، تعداد گام های موردنیاز بیش از این خواهد بود زیرا هر کتابخانه حاوی تعداد زیادتری از کلون هاست.