...Sniper Cloning

تعیین توالی نسل بعدی (NGS) همواره به عنوان یک ابزار تحلیلی در نظر گرفته شده است. در حال حاضر محققان آن را به یک ابزار مقدماتی برای جدا کردن توالی های الیگونوکلئوتیدی خاص بدون خطا از استخر بسیار پیچیده ای از الیگونوکلئوتید های ایجاد شده توسط میکروآری تبدیل کرده اند.  

رشد سریع زیست شناسی سنتتیک و ژنومیکس کاربردی نیاز به سنتز فزاینده قطعات بزرگتری از DNA را موجب شده است. نوشتن چنین مولکول های DNA طویلی به مونتاژ گام به گام الیگونوکلئوتید های خالص از توالی های خوب بستگی دارد، که در زمانی که توسط سنتز الیگونوکلئوتیدی فاز جامد استاندارد انجام می شود، می تواند پر هزینه و مستعد خطا باشد.

با توسعه همزمان سنتز الیگونوکلئوتیدی قابل برنامه ریزی با استفاده ازmicroarray  پیشرفت های عمده ای بوجود آمد که می تواند میلیون ها توالی را در یک استخر مختلط از یک آرایه و تنها در یک دور و با صرف جویی قابل توجهی در هزینه و زمان تولید کند. کلونینگ با استفاده از روش های مرسوم و توسط تعیین توالی سانگر غیر عملی و توان بسیار پایینی دارد.

این مشکلی بود که Duhee Bang (زیست شناس سنتتیک در دانشگاه یونسی) و Sunghoon Kwon (مهندس برق و زیست در دانشگاه ملی سئول)  با آن مواجه شدند. 5 سال پیش، Bang تلاشی را در مهندسی در مقیاس ژنوم باکتری  E.coli انجام داد و با مشکل بزرگی در رابطه با آماده سازی الیگونوکلئوتید هایی با کیفیت بالا برای اصلاح ژن مقاوم در برابر آلودگی E.coli روبرو شد. Kwon می گوید:  پروفسور Bang چند مشکل فنی در استفاده از استخر میکروآری مطرح کرد و گروه ما این چالش های فنی را پذیرفت.

Bang و Kwon با اضافه کردن پرایمر های بارکد شده خاص به استخر میکروآری ایجاد شده از الیگونوکلئوتید ها، برای اولین بار سعی در انتخاب الیگونوکلئوتید ها کردند و سپس توسط تعیین توالی نسل بعدی (NGS) الیگونوکلئوتید ها تعیین توالی شد. با این رویکرد و با استفاده مناسب از این جفت پرایمر های بارکد شده می توان به صورت انتخابی تعیین توالی بدون خطا را افزایش داد. با این حال این روش، از توالی های پیچیده و از دست رفته  رنج می برد، آنها دریافتند که زمان و هزینه طراحی و سنتز تعداد زیادی از آغازگرهای بارکد شده مانعی عمده در افزایس پذیری روش بود.

در سال 2010 گروه Church بحث megacloningرا مطرح کرد که از NGS استفاده می کند تا بعد از NGS بدون نیاز به تکثیر PCR انتخابی، بطور مستقیم کلون های توالی را از استخر الیگونوکلئوتیدی پیچیده انتخاب کند. این کار با استفاده از پلت فرم Roche 454 Life Sciences’ GLS قابل انجام است.

به گفته Kwon، مفهوم استفاده مستقیم از کلون در سوبسترای NGS تکان خوردن دوباره بود، اما او به عنوان یک مهندس، احساس کرد که اتاقی برای بهبود روش وجود دارد. حاصل کار با نیاز به بازیابی مبتنی بر تماس فیزیکی دانه ها محدود شد، و روشی ناکافی برای تولید تعداد زیادی از الیگونوکلئوتید های لازم برای نوشتن قطعه DNA با اندازه مگا باز را ایجاد کرد.

Bang و Kwon نسخه ای از روش  megacloning را بهبود دادند (Sniper Cloning) که اخیرا در Nature منتشر شد. تغییر کلیدی آنها در استفاده از یک سیستم لیزری با پالس کاملا اتوماتیک برای بازیابی بسیار سریع و غیر تماسی دانه های مورد نظر از PTP (Picotiterplate) می باشد. آنها هوشمندانه مزایای ساختار PTPرا بکار بردند، جایی که در آن هر well  که یک مهره را نگه می دارد توسط حک کردن یک انتهای هسته نوری فیبر تشکیل می شود و نور آزاد شده از دانه ها را در طول pyrosequencing  هدایت می کند. این رویکرد تا حد زیادی احتمال آلودگی متقاطع megacloning را کاهش می دهد و با استفاده از یک مرحله خودکار، سریع تر از بازیابی مهره های انتخاب شده از PTP پیش  می رود.

Sniper Cloning همچنین از یک الگوریتم نقشه برداری استفاده می کند تا به دقت هر well در یک PTP را که حاوی دانه مربوط به دنباله الیگونوکلئوتیدی مورد نظر است را تعیین کند. این نقشه برداری به چیدمان دقیق از نقشه پیکسلی داده توالی به دست آمده توسط CCD نیاز دارد. Kwon می گوید: Bang و Kwon در ابتدا الگوریتم نقشه برداری مورد استفاده در megacloning را آزمایش کردند و متوجه شدند که الگوریتم آنها در یک منطقه کوچک و با نشانگر طبیعی مشخص نتایج بسیار خوبی نشان می دهد. اما الگوریتم نمی تواند به عنوان یک روش عمومی برای شناسایی تمام مهره های مفید کلونال در کل منطقه بکار گرفته شود. با بزرگتر شدن منطقه مورد نظر خطای تصویربرداری و خطا کمی نیز افزایش می یابد. با توسعه یک الگوریتم نقشه برداری محلی مبتنی بر انتشار، ممکن بود که این منابع خطاهای موقعیتی حذف شود و به درستی کل PTP نقشه برداری شود.

Sniper Cloning با ترکیب DNA میکروآری، NGS و بازیابی لیزر پالسی، قادر است تا از یک دور NGS در یک استخر میکروآری، 5188 توالی الیگونوکلئوتیدی بدون خطا را در عرض 1 هفته تولید کند. این سیستم همچنین برای سیستم های NGS مبتنی بر بدون مهره (مانند ایلومینا) قابل اجرا است، که در آن DNA برای تعیین توالی به طور مستقیم به عنوان یک خوشه ای به سطح سوبسترای توالی متصل شده است.

منبع:

1. Matzas M, Stähler PF, Kefer N, Siebelt N, Boisguérin V, Leonard JT, Keller A, Stähler CF, Häberle P, Gharizadeh B, Babrzadeh F, Church GM. 2010. High-fidelity gene synthesis by retrieval of sequence-verified DNA identified using high-throughput pyrosequencing. Nat Biotechnol. 2010 Dec;28(12):1291-4. doi: 10.1038/nbt.1710

2. Lee H, Kim H, Kim S, Ryu T, Kim H, Bang D, Kwon S. 2015. A high-throughput optomechanical retrieval method for sequence-verified clonal DNA from the NGS platform. Nat Commun. 2015 Feb 2;6:6073. doi: 10.1038/ncomms7073.