چگونه تعداد کپی های DNA را در هر نمونه محاسبه کنیم..؟

این موضوع ها همیشه ترسناک جلوه می کنند، این طور نیست؟ برای من که همیشه اینطور بوده. اما نگران نباشید، همیشه در انتهای این تونل های تاریک با اندکی صبر و پشتکار به روشنایی می رسیم، فقط کافیست مسیر را ادامه دهیم. 

 

در این بخش چگونگی محاسبه تعداد مولکول های DNA ( یا تعداد کپی) در غلظتی مشخص، را به شما آموزش می دهیم. به عنوان مثال در انتها خواهید توانست تعداد کپی( یا مقدار الگو) یک قطعه ۵۰ جفت بازی (۵۰bp) را در محلولی با غلظت ۵۰۰ نانوگرم محاسبه کنید.

مواردی که تعیین تعداد کپی در آنها مورد نیاز است:

1. مهندسی ژنتیک
2. سنجش های بیوشیمیایی
3. Rel-Time PCR( هنگام محاسبه دقیق تعداد یا absolute quantification)
4. سنجش لود ویروسی (viral load) یا تعداد ژنوم های ویروسی

خبر خوش این که روش محاسبه برای تمام این موارد یکسان است.

پیش از شروع، یک نکته اساسی وجود دارد که همیشه باید به خاطر بسپاریم:

• میانگین وزنی یک جفت باز DNA در حدود ۶۵۰ دالتون می باشد. این مقدار به صورت ۶۵۰ g/mol (برابر جرم مولکولی) نیز نوشته می شود. این بدان معنی است که بگوییم یک مول از یک جفت باز، وزنی معادل ۶۵۰ گرم خواهد داشت.

بر اساس این نکته جرم مولکولی یا جرم مولی هر قطعه  از DNA  دو رشته ای را میتوان با ضرب کردن طول آن (جفت باز) در ۶۵۰ به دست آورد که جواب به صورت دالتون یا g/mol خواهد بود.

بیایید با هم به یک مثال نگاهی بیاندازیم:

سوال: وزن مولکولی یک پلازمید با طول ۵٫۲  کیلوباز چقدر خواهد بود؟ ( به یاد داشته باشید که ۵٫۲ کیلوباز معادل ۵۲۰۰ جفت باز خواهد شد)

جواب:                                  دالتون یا    ۵۲۰۰ x 650 = 3380000 g/mol

حال می دانیم که چگونه  جرم مولکولی یک الگوی DNA را محاسبه کنیم. در ادامه و با استفاده از عدد آووگادرو (۶٫۰۲۲ x 1023)، محاسبه تعداد مولکول های الگو با استفاده از فرمول زیر امکان پذیر خواهد شد.

 

در این معادله:

نانوگرم مقدار DNA موجود (پلازمید، پرایمر و …) می باشد

۶٫۰۲۲ x 1023 عدد آووگادرو است. “ثابت آووگادرو که به صورت L یا NA نمایش داده می شود، به عنوان تعداد ذرات تشکیل دهنده (معمولا اتم ها یا مولکول ها) در هر مول از یک ماده است.”

طول برابر طول قطعه DNA بر اساس جفت باز است. ( یادتان باشد که به کیلو باز توجه داشته باشید)

مقدار موجود را ضرب در ۱ x 109 می کنیم تا جواب بر حسب نانوگرم بدست آید.

۶۵۰ میانگین وزن مولکولی یک جفت باز است

حالا وقت آن رسیده که این فرمول را با هم در چند مثال به کار بریم

مثال اول در مورد پلازمید:

سوال: شما ۳۰۰ نانوگرم از یک پلازمید ۵٫۲ کیلوبازی دارید. چه تعداد پلازمید در این نمونه وجود دارد؟

جواب   :

                                                              

مثال دوم در مورد پرایمر:

 سوال: اگر ۵۰ نانوگرم از یک پرایمر ۲۰ جفت بازی داشته باشیم چه تعداد کپی از این پرایمر در دست داریم؟

جواب:

                                                              

مثال سوم در مورد محصول PCR:

سوال: شما ۱۵۰ نانوگرم از یک محصول PCR تخلیص شده به طول ۶۷۰ جفت باز دارید. چه تعداد کپی محصول PCR در این نمونه وجود دارد؟

جواب:

                                                              

نکته: این فرمول بر این پایه استوار است که شما تنها یک نوع رشته DNA در نمونه خود دارید پس دقت کنید که محصول PCR شما نباید دارای باند غیر اختصاصی و یا اسمیر باشد.

خوب به نظر می رسه که الان آماده کار با نمونه های خود باشید و متوجه شدید که محاسبه تعداد کپی به صورت عملی کار بسیار سختی نیست. با دانستن طول قطعه DNA و غلظت آن بر حسب نانوگرم به راحتی می توانید تعداد کپی نمونه خود را محاسبه کنید. فقط کافیست که ثابت ها را به خاطر بسپارید.

منبع: بیونت