پژوهشهای علمی در قلمرو دانش بشری ، طبیعتاً تحولاتی را ایجاب می کند و افقهای جدید و جالبی را برای دسترسی به فرآورده های بدیع و نو ، پیش روی جهانیان قرار داده است . یکی از این روشها ، واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) می باشد که اولین بار در سال 1983 توسط مولیس ابداع گردید .
امروزه از PCR در زمینه های مختلف پزشکی و دامپزشکی مخصوصاً تشخیص بیماریها از روی DNA عامل بیماریزا استفاده می گردد . برای شروع آزمایش PCR نیاز به DNA عامل بیماریزا می باشد که این ماده ژنتیکی از نمونه های موجود ( خون ، بافت آلوده ، انگل ، اسکولکس ، جفت ، شیر ، عوامل بیماریزا و ... ) استخراج می گردد . نقطه شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولکولی و تشخیصی ، جدا سازی DNA با درجه خلوص بالا می باشد . دستورالعمل استخراج DNA با پشتوانه ای از دانش بیوشیمی همراه است و نباید صرفاً استفاده از چند ماده انگاشته شود . درک عملکرد هر ماده این امکان را فراهم خواهد نمود که در صورت نبود یک ماده ، از ماده دیگری با کار مشابه استفاده کرد . روشهای مختلفی جهت استخراج DNA وجود دارد که در این مقاله به روشهای کاربردی استخراج DNA از خون و نمونه بافتی اشاره گردیده است .
پژوهش های علمی ، در قلمرو مختلف دانش
بشری طبیعتاً تحولاتی را ایجاب می کند و افقهای جدید و جالبی را برای
دسترسی به فرآورده های بدیع و نو پیش روی جهانیان قرار می دهد . امروزه
تکنیک های جدید حاصل از مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی به تدریج جایگزین
روشهای سنتی و متداول گردیده اند . یکــی از روشهـــای نـــوین و دقیق که
امروزه کاربرد فراوانی پیدا کرده است واکنش زنجیری پلی مراز ( PCR=
Polymerase Chain Reaction ) می باشد که در سال 1983 اولین بار توسط
Mullis ابداع و در سال 1985 اولین مقاله کاربردی آن نوشته شد . با این کشف
، بیولوژی مولکولی دچار تغییر و تحول گردید و تحقیقات پزشکی و دامپزشکی و
بیولوژی در خصوص آن و DNA به سرعت افزایش یافت . ویژگیهای و خصوصیات زیاد
این تکنیک از جمله سرعت و دقت بالای آن در تشخیص عوامل بیماریزا در مقایسه
با روشهای معمول و متداول مورد استفاده در آزمایشگاهها ، باعث گردیده است
تا محققین به تدریج آن را جایگزین روشهای سنتی نمایند . امروزه در بسیاری
از مراکز تحقیقاتی و تشخیصی از این روش برای تشخیص ارگانیسمهای مختلف (
باکتری ها ، ویروسها ، انگلها و قارچها ) استفاده می گردد . با این روش ما
می توانیم هر ژنی را از هر میکروارگانیسم زنده ای جدا کنیم . از PCR در
زمینه های مختلف از قبیل تعیین خصوصیات ژنها ، کلونینگ ، تشخیص پاتوژنها از
روی DNA عوامل بیماریزا ، تشخیص بیماریهای ژنتیکی قبل از تولد ، تعیین
جنسیت جنین ، تشخیص سرطانها و تعیین هویت افراد استفاده می گردد . این روش
هم اکنون به عنوان یک روش آزمایشگاهی تحقیقاتی و تشخیصی مطرح شده است ( 8 )
. در سال 1985 فقط 38 گزارش کار عملی و در سال 1986 ، فقط 91 گزارش عملی
در زمینه PCR وجود داشته در حالیکه در سال 1999 حدود 160000 مقاله علمی در
این خصوص به چاپ رسیده است .
PCR یک روش آزمایشگاهی خارج از بدن می
باشد که قطعه خاصی از DNA ( قطعه بین دو توالی DNA ) را تکثیر می کند .
لذا برای انجام آزمایش PCR نیاز به مولکول دو رشته ای DNA داریم که
این مولکول باید از نمونه های موجود ( خون ، بافت ، انگل ، اسکولکس ، جفت ،
عوامل بیماریزا و … ) استخراج گردد . همچنین از DNA تهیه شده می توان
در آینده در ساخت واکسنهای DNA استفاده نمود . روش های آزمایشگاهی مختلفی
جهت تخلیص DNA موجود می باشد.
در سال 1953 ساختمان مارپیچ دو رشته
ای DNA توسط واتسون و کریک مشخص شد و کلیه خصوصیات DNA در حد مولکول قابل
تفسیر گردید و اثر مواد موتاژن ( جهش زا ) در DNA نیز معلوم گردید .
DNA مسئول توارث است و ترتیب اسید آمینه را در پروتئین تنظیم می کند .
مهمترین خصوصیت DNA ساختمان مارپیچ دو رشته ای آن است که در دو رشته
پلیمری باریک و بسیار طولانی مانند طناب دور هم پیچیده اند تشکیل شده است .
قطر مارپیچ در حدود 20 آنگستروم و در هر 34 آنگستروم یک دور کامل می زند .
هر زنجیره از تعداد بیشماری نوکلئوتید که به هم متصل شده است ساخته شده
است . هر نوکلئوتید در DNA از یک قند 5 کربنه دی اکسی ریبوز ، یک باز (
پورین یا پیریمیدین ) و یک گروه فسفر تشکیل شده است . که قند به ریشه فسفات
نوکلئوتید بعدی متصل می شود . در حقیقت ستون فقرات زنجیره DNA را قند دی
اکسی ریبوز و گروه فسفات می سازد که در تمام نوکلئوتیدها یکسان می باشد .
حلقه 5 کربنه قند را 1 تا 5 نامگذاری می کنند تا با حلقه های باز اشتباه
نشود .
دو زنجیر به وسیله پیوندهای هیدروژنی متعدد که بین بازها ایجاد
می شود به هم متصل می شوند . آنچه در این ساختمان مهم است این است که
بازهای آدنین مقابل تیمین با دو پیوند هیدروژنی ( A = T ) . بازهای
سیتوزینی مقابل گوانین با سه پیوند هیدورژنی ( C = G ) قرار دارد . بدین
صورت یک باز پوزین ( آدنین و گوانین ) در مقابل یک باز پیریمیدین ( تیمین و
سیتوزین ) در زنجیره دیگر قرار می گیرد و مارپیچ منظمی را به وجــود مــی
آورند . اگر DNA را تا حدود 100 درجه سانتی گراد حرارت دهیم پیوندهای
هیدروژنی شکسته می شود و دو رشتــه از هم جدا می شوند . در صورتی که مجدداً
سرد شوند هر رشته جفت و مکمل خود را پیدا می کند و پیوندهای هیدروژنی بین
آنها به وجود می آید و رشته های مارپیچ دوباره تشکیل می شود . دو اختلاف در
رشته های DNA و RNA وجود دارد که یکی مربوط به قند آنهاست که قند در
DNA دی اکسید ریبوز است ولی RNA ریبوز می باشد و دیگری اختلاف در باز می
باشد که در رشته RNA باز اوراسیل در مقابل آدنین قرار می گیرد ( U = A )
اما در DNA باز تیمین در مقابل آدنین قرار می گیرد .
نقطه شروع بسیاری از روشهای بیولوژی
مولکولی ضرورت جداسازی DNA با کیفیت عالی است . معمولاً کیفیت DNA با
عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی از RNA ، لیپید و سایر ساختارهایی که برای
آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد می کنند سنجیده می شود ( 1 و 2 )
. به علت بزرگ بوده اندازه مولکول DNA ، روشهای استخراجی باید حداقل
استرس مکانیکی را در طی مراحل استخراج ایجاد نماید . معمولاً روشهایی که در
آنها چندین شوینده همچون SDS و TRITON X100 استفاده میشود که نقش آنها
لیز نمودن سلول و کمک به از بین بردن پروتئین متصل به DNA می باشد .
پروتئین زدایی بیشتر از طریق پروتئناز K صورت می گیرد که این ماده در بافر
لیز کننده مورد استفاده قرار می گیرد ( 2 ) . این آنزیم در حضور SDS در
دمای 65-56 درجه سانتیگراد فعالیت دارد. تحت این شرایط پروتئین بهتر واسرشت
می شود . برعکس در همین شرایط آنزیمهای دیگری مثل DNAase دناتوره می شود .
متعاقب استفاده از پروتئیناز K ایزوپروپانول برای از بین بردن مؤثر
پروتئین ها استفاده می شود . و باقیمانده پروتئین و لیپید نیز به طور مؤثر
از طریق کاربرد فنل و کلروفرم از بین می رود . آلودگی RNA از طریق تیمار
کردن نمونه با RNAase از بین می رود . در روشهای دیگر بعد از پروتئیناز از
نمک اشباع برای رفع آلودگی پروتئین استفاده می شود . در استخراج DNA بهتر
است از هپارین استفاده نشود چون هپارین فعالیت Taq پلی مراز جلوگیری می کند
. وجود EDTA به میزان حداقل 2 Mm در بافر استخراج باعث می شود که
کوانزیمهای DNAase با EDTA شلات می شود و از تجزیه تصادفی DNA جلوگیری
نماید ( 1 و 2 و 3 ) .
شیوه هایی که جهت خالص سازی DNA مورد استفاده
قرار می گیرد علاوه بر برخورداری از حداقل زمان و سرعت بالا ، روش مطمئنی
جهت حذف ممانعت کننده ها ( inhibiators ) و خالص نموده کلیه اسید های
نوکلئیک نیز باشد . این ممانعت کننده ها گوناگون بوده و می توانند در
ارتباط به نوع نمونه متفاوت باشند . در صورتیکه خالص نمودن DNA در نمونه
از کیفیت پایینی برخوردار باشد ، بواسطه اثر مهار کنندگی مواد موجود در
نمونه ها و یا مواد استفاده شده در مراحل خالص سازی ، بر فعالیت پلیمراز
اثر گذاشته و نتیجه تست منفی کاذب خواهد گردید .
دستورالعمل استخراج
DNA با پشتوانه ای از دانش بیوشیمی همراه است و نباید صرفاً استفاده از
چند ماده انگاشته شود . درک عملکرد هر ماده این امکان را فراهم خواهد نمود
که در صورت نبود یک ماده ، از ماده دیگری با کار مشابه استفاده کرد .
روشهای مختلفی برای تخلیص DNA وجود دارد که در اینجا به چند روش برای
تخلیص DNA از خون و نمونه های بافتی می پردازیم .
بــرای تخلیـص DNA از گلبولهای سفید خون
استفاده می شود . برای این کار چندین روش از جمله روش فنل – کلروفرم ، روش
پروتئیناز K ، روش جوشاندن ، روش اسید – گوانیدیوم – فنل – کلروفرم (
AGPC ) و … استفاده می شود که در اینجا دو روش پروتئیناز K و روش جوشاندن
به علت کم هزینه بودن آنها شرح داده می شود .
مواد مورد نیاز :
1 – بافر لیز کننده گلبولهای قرمز ( بافر R ) : که شامل مواد زیر می باشد :
- باز تریس با PH = 7/5 10 میلی مولار
- ساکارز 32% مولار
- کلرید منیزیم ( MgCl 2 ) 10 میلی مولار یا 5 میلی مولار
- تریتون 100X 1%
مخلوط کرده و حجم را با آب مقطر به 50 میلی لیتر می رسانیم .
2 – محلول ( I ) : هیدروکسید سدیم ( NaOH ) 50 میلی مولار
3 – محلول ( II ) . باز تریس یک مولار
روش کار:
نیـم میلی لیتر خون فاقد هپارین را در میکروتیوب ریخته و به آن یک میلی
لیتر بافر R اضافه می کنیم و خوب مخلوط می کنیم . سپس به مدت دو دقیقه با
شدت 1000 دور در دقیقه آنرا سانتریفوژ می کنیم . بعد محلول رویی که حاوی
گلبولهای قرمز لیزشده و پلاسمای خون می باشد را دور ریخته و مجدداً حدود
200 میکرو لیتر بافر R به میکروتیوب اضافه کرده و هم می زنیم تا رسوب موجود
در میکروتیوب به رنگ سفید در آید و مجدداً با شدت1000دور در دقیقه
سانتریفوژ می کنیم . این عمل را تا تهیه رسوب کاملاً سفید ادامه می دهیم .
در مرحله بعد 100 میکرولیتر محلول(I) بر روی رسوب ریخته و آنقدر هم می زنیم
تا رسوب حل شود . سپس میکرو تیوبها را به مدت 20 دقیقــه در آب جــوش
قــرار داده تا گلبولهای سفید لیز شوند . در آخرین مرحله 20 میکـرولـیتر
محـلول (II) را بـه میکروتیوپ اضافه می کنیــم . ( ایــن محلول باعث
نگهداری و حفاظت DNA در محلول می شود) و هم می زنیم و سپس به مدت 30-20
ثانیه با دور 1000 سانتریفوژ می کنیم و در نهایت محلول رویی که حاوی DNA می
باشد با احتیاط به یک میکروتیوپ جدید منتقل می کنیم . سپس با اتانل مطلق
DNA را رسوب می دهیم.
بحث :
روش جوشاندن دارای معایب و
محاسن متعددی است . این روش اصولاً دارای مرحله ای تحت عنوان خالص سازی نمی
باشد ، بلکه توانایی آن تنها از این نظر مهم میباشد که میتواند DNA را در
دسترس قرار دهد . علاوه بر این مواد مصرفی در این روش کمتر بوده و در زمان
کوتاه امکان کار با نمونه های انبوه وجود داشته و آلودگی در آزمایشگاه نیز
کمتر خواهد بود . از معایب این روش هم عدم حذف کامل مهار کننده ها می باشد
و دیگر اینکه روش جوشاندن قادر به استفاده نمونه های با مقادیر کم DNA
نمی باشد . با وجود معایب متعدد آن بواسطه سرعت مطلوب این روش در بسیاری از
آزمایشگاههای تشخیص طبی که از PCR استفاده می گردد برای آماده نمودن DNA
از آن استفاده می نمایند( 7 ) . با استفاده ازاین روش می توان به آسانی
از خون تازه ، لخته شده ، کهنه و خشک و همچنین عوامل بیماریزا DNA را
استخراج کرد.
مواد مورد نیاز :
1 – بافر لیزکننده گلبولهای قرمز ( بافر R )
2 – بافرP که شامل مواد زیر می باشد :
- اتیلن دی آمین تترااستیک اسید ( EDTA ) با 2/8 = PH 2 میلی مولار
- باز تریس 10 میلی مولار
- کلرید سدیم ( NaCl ) 44% مولار
3 – محلول S : سدیم دودسیل سولفات ( SDS ) 10%
4 – محلول N : کلرید سدیم ( NaCl ) 4 مولار
5 – محلول TE که شامل مواد زیر می باشد :
- EDTA با 8 = PH 1 میلی مولار
- باز تریس با 6/7 = PH 10 میلی مولار
6
– پروتئیناز K : از این آنزیم با غلظت 20 میلی گرم در میلی لیتر (
mg/ml 20 ) استفاده می شود که پروتئینهای هیستونی و غیر هیستونی در DNA
را تخریب می کند . این آنزیم در دمای 55 درجه سانتی گراد بهترین فعالیت را
دارا می باشد .
7 – اتانل مطلق و اتانل 70 درصد
روش کار :
نیــم میلی لیتر خون را در یک میکروتیوب ریخته و برای لیز کردن گلبولهای
قرمز به آن به میزان یک میلی لیتر بافر R اضافه می کنیم خوب مخلوط کرده و
با دور xg 1000 به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ انجام می گردد . پس از سانتریفوژ
، محلول رویی که حاوی گلبولهای قرمز لیز شده و پلاسمای خون می باشد را دور
ریخته و مجدداً حدود 500-200 میکرولیتر بافر R به میکروتیوب اضافه می
کنیم و بعد سانتریفوژ انجام می گیرد . این کار را تا به دست آوردن رسوب
سفیــد رنگ در میکروتیــوب ادامــه می دهیــم . پس از تهیه رسوب سفید ، 300
میکرولیتر بافر P به منظور لیز کردن گلبــولهای سفید به مبکروتیوب اضافه
می کنیم و پس از هم زدن ، به میزان 20 میکرولیتر محلول S ( جهت دناتوره
کردن پروتئینها ) به میکروتیوب اضافه می کنیم و آنقدر هم می زنیم تا رسوب
کاملاً حل گردد . بعد به میزان 5 میکرولیتر از آنزیم پروتئیناز K ( mg/ml
20 ) به میکروتیوب اضافه کرده و خوب حل می کنیم . سپس میکروتیوبها در دمای
55 درجه سانتی گراد و به مدت یک ساعت انکوبه می شوند ( در طول شب در دمای
37 درجه نیز قرار داده می شود . ) بایستی هر 5 دقیقه یکبار محتویات
میکروتیوب را هم زد . پس از گذشت این زمان ، صد میکرولیتر محلول N به
لوله اضافه شده و به طور مختصر هم می زنیم و بعد به مدت 30 – 10 دقیقه در
یخ قرار داده تا حالت ابری ( به علت رسوب پروتئینها ) در محلول داخل
میکروتیوب مشاهده شود . میکروتیوب را به مدت 10 دقیقه با دور xg 1000
سانتریفوژ می کنیم و محلول شفاف رویی با احتیاط به میکروتیوبهای جدید منتقل
می شود . ( رسوب موجود حاوی پروتئینهای دناتوره می باشد . ) به محلول رویی
جدا شده یک میلی لیتر اتانول مطلق سرد اضــافه شــده و بــه آرامــی هــم
می زنیم . تا کلافهای شیری رنگ DNA مشاهده شود . سپس مدت 10 دقیقه با دور
xg 1000 سانتریفوژ نموده و محلول رویی را دور ریخته و بر روی رسوب (
مولکولهای DNA ) باقی مانده صد میکرولیتر اتانل 70 درصد ریخته ( جهت شستشو
) و خوب هم می زنیم و سپس برای مدت 2 دقیقه با دور xg 1000 سانتریفوژ می
کنیم . محلول رویی را دور ریخته و میکروتیوبها را به کمک حرارت در زیر هود و
درجه حرارت اتانل خشک می کنیم و سپس به هر یک از میکروتیوبها 100
میکرولیتر بافر TE یا آب مقطر بدون یون اضافه کرده و به آرامی به هم زده
تا رسوب DNA حل شود . برای حل شدن بهتر DNA می تونا از حرارت 60 درجه
ســـانتی گراد حمام بخار آب جوش استفاده می شود.
روشهای مختلفی از قبیل آنزیم تریپین ، روش
جوشاندن ، روش اسید گوانیدیم فنل کلروفرم ( AGPC ) ، روش TRIzoL و
DNAzoL وجود دارد که در اینجا به شرح چند روش می پردازیم :
این محلول که حاوی فنل و گوانیدین ایزوسیانات می باشد به صورت تجاری موجود می باشد .
مواد مورد نیاز :
1 – ترایزول
2 – اتانل مطلق و اتانل 75 درجه
3 – سود 8/0 مولار
4 – کلروفرم
5 – سیترات سدیم 1/0 مول در اتانل 10 درصد
روش کار :
100 – 50 میلی گرم نمونه بافتی ( کرم یا
اسکولکس ) را در داخل هموژنیزر یا یک هاون کوچک قرار داده و نمونه را
کاملاً خرد می نمائیم ( بهتر است ابتدا با قیچی نمونه به قطعات کوچک تقسیم
نمود . ) در صورتی که نمونه در هاون ساییده شود مقداری شن استریل روی آن
ریخته تا کاملاً سائیده شود . سپس به آن یک میلی لیتر ترایزول اضافه نموده و
خوب مخلوط می کنیم و آن را داخل میکروتیوب ریخته و برای مدت 5 دقیقه نمونه
هموژنیزه شده را در دمای 30 – 15 درجه سانتی گراد قرار می دهیم تا
پروتئینها دناتوره شوند . سپس در آن به هر میکروتیوب 200 میکرولیتر
کلروفرم اضـافه نموده وآنها را به شدت برای 15 ثانیه با دست تکان داده و
برای مدت 3 – 2 دقیقه در دمای 30 – 15 درجه سانتی گراد قرار می دهیم و سپس
با دور xg 12000 برای مدت 15 دقیقه سانتریفوژ می کنیم . ( در صورتی که
سانتریفوژ یخچالدار موجود باشد در دمای 8 – 2 درجه سانتی گراد سانتریفوژ
انجام می گیرد ) . سپس سه فاز در میکروتیوب در میکروتیوب ایجاد می شود .
فاز پایینی قرمز ، فاز وسط حاوی فنل و کلروفرم و فاز بالایی بی رنگ می باشد
و حاوی RNA است .تمام فاز بالایی را به دقت خارج کرده و دور می ریزیم .
فاز وسط و فاز ارگانیک ( پایین ) را به داخل میکروتیوب جدید ریخته و به آن
300 میکرولیتر اتانل مطلق اضافه می کنیم و با خم و راست کردن دست محتویات
داخل میکروتیوب را مخلوط می کنیم . نمونه را به مدت 3 – 2 دقیقه در دمای 30
– 15 درجه سانتی گراد قرار می دهیم تا DNA ته نشین گردد . سپس به مدت 5
دقیقه با دور 2000 سانتریفوژ نمونه تا پلیت DNA در ته میکروتیوب تشکیل
گردد بعد مایع رویی را دور ریخته و پلیت DNA در میکروتیوب باقی می ماند .
پلیــت DNA را دو مرتبــه با محلول
سیترات سدیم 1/0 مول در اتانل 10% شستشو می دهیم ( هر بار با یک میلی لیتر )
. در هر بار شستشـو پــلیت DNA را بــرای مــدت 30 دقیقه در محلول
سیترات سدیم در دمای 30 – 15 درجه سانتی گراد قرار داده و هر چند دقیقه
یکبار آن را تکان داده و مخلوط می نمائیم و سپس برای مدت 5 دقیقه با دور
XG 2000 سانتریفوژ می نمائیم . مایع رویی را دور ریخته و به آن 2 – 5/1
میلی لیتر اتانل 75درجه به پلیت DNA اضافه نموده و برای 20 – 10 دقیقه در
دمای 30 – 15 درجه سانتی گراد قرار می دهیم و سپس برای مدت 5 دقیقه مجدداً
با دور XG 2000 سانتریفوژ می کنیم و بعد مایع رویی را خارج کرده و پلیت
DNA در لوله باقی می ماند .
پلیت DNA را برای مدت 10 – 5 دقیقه در
زیر هود یا در خلاء خشک نموده و سپس به ازای هر 70 – 50 گرم نمــونه
بــافتــی ، 600-300 میلی لیتر سود 8میلی مولار به DNAی جدا شده اضافه می
کنیم . ( محلول بازی می تواند ثبات DNA را حفظ کند . ) ممکن است پس از حل
کردن DNA در سود موادهای غیرقابل حل ژلاتین به وجود آیــد که آن را با
سانتریفوژ کــردن بـــا دور xg 12000 برای مدت 10 دقیقه رسوب داده و مایع
رویی ( DNA ) را به یک میکروتیوب جدید منتقل می کنیم و برای انجام PCR از
آن استفاده می کنیم .
این روش بیشتر برای استخراج تک یاخته ها مخصوصاً توکسوپلاسما استفاده می شود .
روش کار :
حدود
یک گرم از نمونه را داخل لوله آزمایش ریخته و روی آن 300 میلی لیتر
تریپسین 5/0 درصد اضافه می کنیم و پس از 15 ثانیه ( زمانی که بافتها از هم
جدا شدند ) آن را با دور xg 10000 برای مدت 2-1 دقیقه سانتریفوژ می
نمائیم . سپس تریپسین را خارج نموده ( مایع رویی ) و به آن سود 50 میلی
مولار حدود 100 میکرو لیتر اضافه می نمائیم . لوله را چند مرتبه معکوس
نموده تا بافت در سود حل شود . سپس برای مدت 20 دقیقه در حمام بخار آب جوش
قرار می دهیم و پس از آن حدود 20 میکرولیتر M10 TrisHCl دارای 5/7 = PH
اضافه نموده و چند مرتبه آهسته آن را معکوس نموده و آنرا با دور xg 13000
( یا بالاترین دور سانتریفوژ ) به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ می نمائیم . سپس
مایع رویی که حاوی DNA می باشد را در یک لوله تمیز منتقل کرده و برای
آزمایش PCR مورد استفاده قرار می دهیم .
مواد مورد نیاز :
1 – محلول D : که شامل مواد زیر می شود :
گوانیدیوم تیوسیانات – سارکوسیل – مرکایتو اتانل و سیترات سدیم سدیم 2 مول یا 75/0 مول
2 – کلروفرم – ایزوآمیل الکل به نسبت 49 به 1
3 – اتانل مطلق و اتانل 70 درصد
طرز تهیه محلول D :
250
میلی گرم گوانیدیوم تیوسیانات را در 293 میلی لیتر آب مقطر استریل حل کرده
و 6/17 میلی لیتر سیترات سدیم 75/0 مول با 7 = PH و 4/26 میلی لیتر
سارکوسیل 10 درصد اضافه می نمائیم محلول را تا دمای 65 درجه سانتی گراد در
بن ماری حرارت داده تا کاملاً حل شود و شفاف گردد . این محلول را می توان
برای چندین ماه در شیشه های تیره در درجه حرارت اتاق نگهداری نمود . در
زمان مصرف به 5 میلی لیتر از این محلول 36/0 میلی لیتر مرکاپتو اتانل اضافه
می شود. این محلول را نباید بیش از یک ماه نگهداری نمود .
روش کار AGPC :
یــک گرم نمونه را با قیچی کاملاً استریل خورد کرده وآن را با هاون حاوی
شن استریل و یا در یک هموژنیزر شیشه ای ریخته و آن را کاملاً می ساییم . (
از 1/0 گرم نمونه نیز استفاده می شود که در این صورت باید محلول به نسبت 1
به 10 استفاده شود ) . سپس به میزان 4 میلی لیتر محلول D اضافه نموده و
مجدد نمونه ای را داخل این محلول می ساییم و داخل یک لوله 50 میلی لیتری می
ریزیم سپس 4/0 میلی لیتر سیترات سدیم 2 مول با 2/4 = PH اضافه نموده و
مخلوط می کنیم . هم حجم محلول D ( 4 میلی لیتر بافر اشباع شده یا فنل
استفاده می کنیم و مخلوط می نماییم . سپس 8/0 میلی لیتر کلروفرم – ایزوآمیل
الکل ( 49 به 1 ) اضافه نموده و با خم و راست کردن لوله به مدت 20 – 10
ثانیه محلول را مخلوط نموده و سپس برای مدت 20 دقیقه بر روی یخ قرار می
دهیم . محلول داخل لوله را با دور xg 10000 یا بالاترین دور به مدت 20
دقیقه سانتریفوژ می نماییم . مایع بالایی که حاوی DNA می باشد را داخل
لوله تمیز دیگر می ریزیم و 10 میلی لیتر اتانل مطلق به آن اضافه کرده تا
DNA توسط اتانل رسوب نماید و برای حداقل 2 ساعت در دمای 20 درجه سانتی
گراد فریزر قرار می دهیم . سپس آن را با دور حداکثر برای مدت 10 دقیقه
سانتریفوژ می نماییم مایع رویی را خارج کرده و دو مرتبه پلیت DNA را با
اتانل 70 درصد شستشو می دهیم و با دور حداکثر برای مدت 5 دقیقه سانتریفوژ
می نماییم . لوله حاوی DNA را به طور وارونه در زیر هود یا خلاء قرار داده
تا خشک شود . بعد غلظت DNA را با اضافه کردن آب به mg/ml 1 می رسانیم .
این DNA را می توان در PCR به کار برد .
بحث :
در روش
فوق میزان DNA بدست آمده نسبت به روش جوشاندن بیشتر خواهد بود و در
مقایسه با آن از قدرت تخلیص بالاتری برخوردار میباشد . از معایب این روش
این است که مقدار کم فنل باقی مانده در محلول خالص شده می تواند اثر مهار
کنندگی داشته باشد .
بعد از تخلیص DNA با استفاده از
روشهای مختلف باید غلظت DNA بدست آمده را تعیین کرد. برای این منظور از دو
روش استفاده می شود :1) روش الکتروفورز 2) روش اسپکتوفتومتری
1 – روش الکتروفورز :
در این روش نمونه DNA ی تخلیص شده را همراه با شناساگرهایی ( مارکر ) که
غلظت آنها مشخص است الکتروفورز کرده و با مقایسه باندهای ایجاد شده مربوطه
به DNA تخلیص شده با باند مارکر می توان به طور کیفی مقدار DNA را مشخص
کرد . برای این منظور 5 میکرولیتر از محلول DNA را به همراه یک میکرولیتر
بافر بارگیری بــر روی ژل آگار 8/0 درصــد نمونــه گذاری کرده و الکتروفورز
می شود . برای دیدن باند DNA بایستی ژل را به مدت 5 دقیقه در محلول
اتیدیوم بروماید ( mg/ml 5/0 ) قرار داده و بعد در زیر نور ماوراء بنفش بر
روی دستگاه UV-transiliuminator مشاهده کرد ( و یا می توان اتیدیوم
بروماید را در زمان تهیه به ژن اضافه کرد . )
طرز تهیه ژل الکتروفورز :
برای تهیه ژل الکتروفورز از چندین بافر استفاده می شود که عبارتند از :
1 ) Tris – acetate ( TAE )
2 ) Tris – phosphate ( TPE )
3 ) Tris – borate ( TBE )
4 ) Alkaline
معمولاً بافر TAE بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد .
طرز تهیه :
تهیـــه ژل بستگی به نوع الکتروفورز ، حجم مورد نیاز و اندازه مولکول DNA
دارد . ابتدا مقداری آگارز را وزن کرده و در مقداری از TAE حل می کنیم .
برای مثال اگر بخواهیم 50 میلی لیتر ژل 2% تهیه کنیم یک گرم آگارز را در 50
میلی لیتر TAE حل می کینم ( در داخل ارلن مایر 100 میلی لیتری ) و آنرا
در ماکروویو در درجه حرارت متوسط برای مدت یک دقیقه قرار داده تا آگارز در
آب مقطر حل شود و کاملاً شفاف گردد . ( در صورت نبودن ماکروویو از بن ماری
آب جوش استفاده می کنیم . ) بعد از این مدت می گذاریم تا درجه حرارت محلول
پایین و حدود 70 درجه سانتی گراد بیاید و سپس به آن 10 میکرولیتر اتیدیوم
بروماید mg/ml 1 اضافه می کنیــم ( ایــن ماده بسیار سرطانزا می باشد و
باید با دستکش کار کرد و برای رنگ آمیزی DNA بکار برده می شود . ) محلول
را خوب هم زده و در داخل ظروف مخصوص ژل می ریزیم و نشانه محلول را در داخل
آن قرار می دهیم ، صبر می کنیم تا ژن کاملاً سفت شود سپس نشانه را برداشته و
حفره هایی تشکیل می شود که این حفره ها محل دود کردن ( Louding ) (
بارگیری ) DNA می باشد . برای این کار ژل را داخل الکتروفورز قرار داده و
داخل آن را مقداری ( حدود 50 میلی لیتر ) TAE اضافه کرده تا سطح ژل را
کاملاً بپوشاند سپس به وسیله یک میکروپیپت 8 میکرولیتر DNA را با دو
میکرولیتر Louding dye بر روی یک پارا فیلم مخلوط کرده و سپس آن را به
وسیله از روی پارا فیلم برداشته داخل حفره ژل Loud می کنیم به این ترتیب
نمونه ها را قرار داده و 10 میکرولیتر مارکر را در وسط ژل و یا در دو طرف
Loud می کنند و سپس جریان الکتروفورز را به سرعت ، با ولتاژ 70 میلــی
ولـــت بـــرقـــرار نموده ، پس از یک ساعت ژل را بر روی
UV-Transilluminater قرار داده و باندهای DNA را مشاهده می کنیم .
طرز تهیه Gel-Louding dye :
برای تهیه این ژل از موادی چون فیکول ، EDTA ، برموفنل بلو و گزیلول
سیانول استفاده می شود. برای تهیه 5 میلی لیتر از این ژل حدود 1 میلی گرم
فیکول ، 250 میکرولیتر EDTA 5/0 مولار 50 میکرولیتر برموفنل بلو 5 درصد و
50 میکرولیتر گزیلول سیانول 03/0 درصد استفاده می شود . این ژل به طور
تجاری نیز وجود دارد .
2 – روش اسپکتوفتومتری :
این روش
مهمترین روشی است که برای تعیین غلظت DNA تخلیص شده استفاده می شود . این
روش یک روش کمی بوده و می توان غلظت DNA را با استفاده از جذب نوری در
طول موج 260 نانومتر از طریق فرمول زیر محاسبه کرد :
100 × 50 × جذب در 260 نانومتر = غلظت DNA بر حسب میکرو گرم بر میلی لیتر
جذب
برای یک OD در 260 نانومتر نشان دهنده وجود 50 میکروگرم در میلی لیتر
DNA دو رشته ای در محلول می باشــد . بــا استفاده از این روش می توان
مقدار ناخالصی ناشی از حضور پروتئین را در محلول DNA تعیین نمود. برای این
منظور جذب را بایستی یکبار در طول موج 260 نانومتر ( طول موجی که در آن
DNA حداکثر جذب را دارد ) و بار دیگر در طول موج 280 نانومتر ( که پروتئین
حداکثر جذب را دارد ) اندازه گرفت و با استفاده از نسبت جذب در 260
نانومتر به جذب در 280 نانومتر مقدار ناخالصی را محاسبه کرد . هر چه این
نسبت از 8/1 کمتر باشد شدت آلودگی DNA به پروتئین بیشتر است . اگر ناخالصی
زیاد باشد ( نسبت حدود 3/1 باشد ) بهتر است از آنزیم پروتئیناز K
استفاده گردد .
برگرفته از مقاله روشهای آزمایشگاهی استخراج DNA تالیف مهندس حسن کامکار
با سلام وقت ب خیر.
در روش PCR بعد از استخراج DNA از ظروف شیشه ای کمتراستفاده می شود از آنجا که DNA بار منفی دارد به شیشه با بار مثبت می چسبد. برای جداسازی آن هم می توان از بافر استفاده کرد و هم آب. جسارتا فرق این دو روش چیست؟ با سپاس
سلام.ممنون از وبلاگتون.
ممکنه راجبه روش سزیم کلراید هم توضیح بدین؟
من کنفرانسشو دارم ولی چیزی پیدا نمیکنم ک به درد بخور باشه
بازم وبلاگ شما خیلی خوب و جامع بود
ممنون
مرسی.
سلام و خسته نباشید. میخواستم بدونم فرمول شیمیایی سارکوسیل چی هست. ممنون میشم جواب بدید
با سلام و احترام.
سارکوسیل اسم دیگه ی سدیم لوریل سارکوزین است که یه نوع دترجنته مثل SDS. رمول شیمیاییش هم هست C15H28NNaO3.
موفق باشین